Highly multiplex targeted proteomics assay in plasma using Stellar mass spectrometer with adaptive RT

Význam tématu

Multiplexní cílená proteomika umožňuje současné kvantifikování stovek až tisíců peptidů v komplexních matrix jako je human plasma. Stabilní retenční časy jsou klíčové pro reprodukovatelnost a citlivost, což je zásadní pro validaci biomarkerů v klinických studiích.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout rozsáhlou multiplexní PRM metodu na spektrometru Stellar s adaptivní funkcí alignace retenčního času (adaptive RT) a ověřit ji na plazmatických vzorcích pacientů s kolorektálním karcinomem (CRC). Metoda byla sestavena během tří dnů pomocí standardů PQ500 a následně aplikována na srovnání plazmy zdravých dárců a pacientů.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky plazmy byly digesovány na platformě Thermo Scientific AccelerOme a analyzovány na systému Vanquish Neo UHPLC s EASY-Spray ES906A kolonkou (55 °C). Detekce probíhala na Thermo Scientific Stellar MS v režimech MS2 a MS3 s 30min gradienty. Plánování metodiky a kvantifikace peptidů bylo řízeno softwarem Skyline. Adaptive RT funkce přizpůsobovala posuny retenčního času v reálném čase.

Hlavní výsledky a diskuse

Bylo analyzováno přes 1600 peptidových prekurzorů. Všechny klíčové metriky metody:

• Reprodukovatelnost: více než 94 % peptidů mělo CV < 25 % v plazmě pacientů.
• Linerita: asi 90 % peptidů vykazovalo koeficient R2 > 0,9.
• Citlivost: detekce na úrovni nízkých amol.

Režim MS3 významně zlepšil poměr signál/šum u nízkoubičných nebo interferencemi zatížených peptidů, což vedlo k navýšení identifikací o 10,3 % proteinů a 7,3 % peptidů oproti čistému MS2.
Celkově bylo v plazmě detekováno 292 endogenních proteinů a 472 peptidů, včetně 57 FDA schválených biomarkerů. Mezi 29 proteinů signifikantně změněných v CRC pacientů (>2-násobná změna, adj.p < 0,05) patří SAA2, A2GL, CO9.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí vysokou propustnost a přesnost pro kvantifikaci potenciálních biomarkerů z nízkých objemů plazmy. Adaptive RT zajišťuje spolehlivou sledovatelnost všech cílových peptidů bez potřeby ruční rekalibrace časových oken.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření panelu na více tisíc cílových peptidů, integrace s datově nezávislým získáváním (DIA), plná automatizace workflow a aplikace na personalizovanou medicínu. Dále možnost kombinace s jinými omickými přístupy pro komplexní biomarkerové studie.

Závěr

Vyvinutá multiplexní PRM metoda na Stellar MS s adaptivní RT nabízí robustní quantifikaci stovek proteinů ve 30minutovém běhu. Přesnost, citlivost a automatizace ji řadí mezi perspektivní nástroje pro klinické a průmyslové aplikace.

Reference

1. Juthamard Chantaraamporn et al. Proteomes 2020, 8(3), 26.
2. Bethany Geary et al. Cancers 2021, 13(10), 2443.