A multipathway phosphopeptide assay development using Stellar Mass Spectrometer with adaptive RT for rapid phosphoproteomic

Význam tématu

Phosphoproteomika zaměřená na aktivní smyčky kináz poskytuje přímé indikátory signalizační aktivity buněčných drah relevantních pro onkologii. Cílená měření fosfopeptidů z těchto regulačních oblastí umožňují kvantitativní a biologicky srozumitelné čtení stavů kináz, což je důležité pro biomarkery diagnostiky, prognózy a sledování odpovědi na terapii. Vzhledem k nízké abundanci fosfopeptidů a vysokému pozadí v komplexních vzorcích jsou nezbytné přizpůsobené akviziční strategie (adaptive RT, PRM, případně MS3) a optimalizovaná front-end enrichment metody.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo vyvinout multiplexní cílený assay pro více než 280 těžce značených fosfopeptidů z aktivních smyček lidských kináz tak, aby bylo možné kvantitativně monitorovat stovky fosfosite při jedné LC–MS analýze. Studie představuje implementaci adaptivního plánování retenčních časů (adaptive RT) v PRM režimu na platformě Stellar MS, optimalizaci gradientů, parametrů MS a v případech vysokého spektrálního pozadí i aplikaci MS3 pro zvýšení selektivity a citlivosti.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorky: Standardní směs těžce značených fosfopeptidů (JPT Peptide Technologies) spikeovaná do obohacených HeLa digestů.
• Enrichment: HighSelect Fe-NTA Magnetic Phosphopeptide Enrichment Kit (Thermo Scientific).
• Chromatografie: Vanquish Neo UHPLC v konfiguraci trap-and-elute; IonOpticks/EASY-Spray kolona 75 µm × 25 cm; mobilní fáze A = 0,1 % FA ve vodě, B = 0,1 % FA v 80 % ACN; kolona 50 °C, autosampler 7 °C; finální gradient 45 minut zvolen jako kompromis mezi rozlišením a průchodností.
• Hmotnostní spektrometrie: Thermo Scientific Stellar mass spectrometer; PRM s adaptivním RT (vytvořeno .rtbin souborem z analytických vstupů); použití MS3 pro peptidy s vysokým pozadím. Klíčové parametry: scan range MS1 350–2000 m/z (MS2/MS3 200–1500 m/z), scan rate 125 kDa/s, RF lens 30 %, izolace 2 m/z, HCD aktivace, kolizní energie 23 %, AGC nastaveno na Standard (optimalizováno 100–800 %, finálně 100 %), body-per-peak ~7, Dynamic Injection Time režim.
• Software: Skyline-Daily 26.1.1 pro analýzu dat a PRM conductor pro generování metod.

Hlavní výsledky a diskuse

• Multiplexnost a rozsah: Metoda monitoruje přes 570 precursorů (těžké + lehké), což odpovídá více než 280 těžce značeným fosfopeptidům v jednom 45min LC–MS běhu.
• Adaptivní RT: Implementace .rtbin a adaptivního plánování umožnila užití úzkého retenčního okna ~1,8 minuty pro efektivní plánování PRM skenů a zachování vysokého počtu cílů při zachování dostatečné hustoty bodů na chromatografickém píku.
• MS3 pro snížení pozadí: Pro peptidy s vysokým spektrálním rušením se úspěšně použilo MS3, čímž se výrazně zlepšilo poměru signál/šum a zvýšila se selektivita detekce v obohacených HeLa vzorcích.
• Optimální parametry: Kolizní energie CE=23 a režim Dynamic Injection Time byly vybrány jako nejlepší kompromis mezi intenzitou signálu a kvalitativní robustností. AGC byl testován v rozmezí 100–800 %; intensita peptidů byla konzistentní mezi 100–500 %, a proto bylo zvoleno 100 % pro finální metodu.
• Rozlišení izomerů fosforylace: Většina pozičních izomerů fosfopeptidů byla separována retenčním časem na 45min gradientu a dále rozlišena unikátními fragmentačními ionty, což je klíčové pro přesné čtení signalizace.
• Výkonnost a stabilita: Metoda vykazuje dobrou linearitu, přesnost a preciznost přes široké dynamické rozmezí; většina peptidů zůstala stabilní v autosampleru až 72 hodin, avšak některé peptidy vykazovaly pokles signálu při delším vystavení pokojové teplotě.
• Enrichment efekt: Po obohacení fosfopeptidů z HeLa buněk byly intenzity některých cílových peptidů zvýšeny více než 100×, což dokazující význam kroku enrichmentu pro citlivou detekci.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlé a škálovatelné profilování: Umožňuje kvantifikovat stovky fosfosite během jednoho LC–MS běhu, což je vhodné pro velké studie signálních sítí nebo screening farmakologických zásahů.
• Vysoká selektivita: Kombinace adaptivního RT, PRM a případně MS3 snižuje falešné signály a zlepšuje důvěru v kvantifikaci nízkoabundantních fosfopeptidů.
• Biologická interpretace: Zaměření na aktivní smyčky kináz poskytuje přímo interpretovatelné biomarkery kinázové aktivity (např. GSK, CDK11), užitečné pro výzkum nádorových drah a predikci odpovědi na terapii.
• Robustnost pro laboratorní workflow: Optimalizované chromatografické podmínky, standardní AGC a automatizované plánování zjednodušují transfer metody mezi laboratořemi.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšiřitelnost panelů: Panel lze rozšiřovat o další biologicky relevantní fosfosite a adaptovat na jiné druhy signálních proteinů.
• Integrace s DIA a ion mobility: Kombinace cílených přístupů s datově nezávislou akvizicí nebo ion-mobility separací může zlepšit pokrytí a rozlišení izomerů.
• Automatizace a standardizace: Vyšší míra automatizace přípravy vzorků a jednotné standardní operativní postupy zlepší přenositelnost do klinických laboratorních prostředí.
• Pokročilá bioinformatika: AI/ML pro adaptivní plánování, lepší deconvoluci signálu a robustní vyhodnocení izomerů podpoří rychlejší interpretaci dat.
• Klientské a klinické aplikace: Přechod od výzkumných studií k validovaným klinickým testům bude vyžadovat další klinickou validaci, standardizaci kalibrací a kontrol kvality.

Závěr

Studie předkládá validovaný pracovní postup pro vysoce multiplexní cílenou analýzu fosfopeptidů z aktivních smyček kináz s použitím adaptivního retenčního času na platformě Stellar MS. Kombinace 45min gradientu, adaptivního RT plánování, optimalizovaných MS parametrů a selektivního použití MS3 poskytuje citlivé, selektivní a robustní řešení pro profilování kinázových aktivit v komplexních vzorcích. Metoda má přímé uplatnění v onkologickém výzkumu a představuje solidní základnu pro další rozšiřování panelů i případný klinický transfer.

Reference

1. Cancer Lett. 2013 Sep 2;342(1):104–112.
2. Clin Cancer Res. 2010 Nov 1;16(21):5124-32.