Improvement of throughput and charge assignment accuracy in Orbitrap-based charge detection mass spectrometry with proton transfer charge reduction

Význam tématu

Charge detection mass spectrometry (CDMS) umožňuje přímé stanovení hmotnosti jednotlivých iontů měřením jejich m/z a náboje, což otevírá nové možnosti pro analýzu velkých, heterogenních biomolekul a top-down proteomiku. Přestože CDMS snižuje problémy se spektrem vzniklé z překrývajících se nabitých stavů, omezená kapacita bezpečného vkladu iontů do analyzátoru a potíže s přesným přiřazováním náboje omezují průchodnost a spolehlivost analýzy. Integrace proton transfer charge reduction (PTCR) do Orbitrap-based CDMS může tyto limity zmírnit redistribucí iontů do vyšších m/z oblastí, což zvyšuje počet detekovaných iontů na spektrum a zlepšuje přesnost přiřazení náboje.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem studie bylo prokázat, že použití PTCR před měřením v Orbitrap-based CDMS zlepší: (i) počet iontů detekovaných na jedno spektrum (průchodnost), (ii) citlivost vůči vysokomolemárnímu fragmentu a (iii) přesnost přiřazení náboje, zejména při použití algoritmů typu central limit. Studie využívá bovinní karbonanhydrázu II (bCA II, ~29 kDa) jako modelový analyzát a porovnává výsledky získané s PTCR a bez něj přes sérii 1 600 individuálních-iontových transi entů.

Použitá metodika a instrumentace

Popis vzorku a příprava:

• bCA II připravený výměnou pufru do 200 µM amonium acetátu; pracovní ředění 1:100.

Instrumentace a klíčové moduly:

• Thermo Scientific Orbitrap Apex Tribrid vybavený Direct Mass Technology (DMT) pro Orbitrap-based CDMS.
• Možnosti fragmentace: ETD, HCD a kombinované EThcD.
• Ionizace: Heated electrospray ionization (HESI) pro analytické ionty.
• Reaktantní aniontové zdroje: fluoranthen pro ETD a perfluoroperhydrophenanthrene pro PTCR (vygenerované vestavěným negativním zdrojem).
• Quadrupol pro izolaci iontových obálek (4 Th šířka, centrální m/z 1002, odpovídá ~29+).

Protokol měření (klíčové parametry):

• Izolace obálky: 4 Th kolem m/z 1002.
• Akumulace: nastavená na 150 % cílové hodnoty AIC (Automatic Ion Control).
• ETD krok: 1,25 ms reakce s ETD reaktanty před HCD.
• HCD: 25 % normalizovaná kolizní energie.
• PTCR: volitelný krok 12 ms (v některých experimentech také ilustrován 3 ms PTCR pro porovnání vlivu na algoritmus central limit).
• Data v frekvenční oblasti zpracována v STORIboard softwaru; fragmentní shody provedeny v Proteoform Studio.

Filtrační a validační kritéria (shrnutí):

• Použity přísné filtry pro omezení chybných přiřazení: R2 práh ~0,9; minimální délka signálu; maximální doba vzniku; S/N práh ~1; voting bin size = 3; počet sousedů a izotopových sousedů nastaven.
• Cílem bylo snížit falešně pozitivní charge-assignments při zachování vysoké míry využitelných iontových signálů.

Hlavní výsledky a diskuse

Redistribuce iontů a zvýšení počtu detekovaných iontů:

• Bez PTCR bylo akumulováno ~1,85 milionu iontových signálů napříč 1 600 spektry, z nichž 111 949 bylo jistě přiřazeno nábojem.
• S PTCR bylo nasbíráno ~2,82 milionu iontových signálů za stejný počet spekter, z nichž 312 376 bylo přiřazeno nábojem — tedy přibližně 2,8× nárůst v počtu charge-assigned iontů.
• PTCR přesunul iontové populace do širšího a vyššího m/z pásma, což umožnilo delší injektážní časy a více iontů na jedno akviziční okno při řízení AIC bez překročení limitu signální hustoty.

Zlepšení detekce vysokomassových fragmentů:

• V důsledku konkurenčního potlačení v nízkém m/z regionu byly bez PTCR minoritní vysokomassové, vysoce nabité fragmenty obtížně detekovatelné. PTCR je přesunul do méně obsazených vyšších m/z oblastí, čímž se zvýšila jejich detekovatelnost.
• To vedlo ke znatelnému nárůstu signálu u těžších fragmentů (viz sumarizovaná data a grafické profily v původním textu), s rostoucím ziskem signálu s rostoucí fragmentární hmotností.

Zvýšení přesnosti přiřazení náboje a vliv algoritmů:

• Algoritmus "voting" určil heterogenitu izolované obálky bCA (29,05 kDa ~88,6 % a 30,00 kDa ~11,5 %).
• Algoritmus "central limit", který se běžně používá pro případy s nerozlišenými izotopickými rozděleními, přiřadil bez PTCR pouze ~15,6 % iontů k 29,05 kDa populaci. Po 3 ms PTCR se podíl přiřazených iontů zvýšil na ~57,6 % — výrazné zlepšení spolehlivosti central-limit přístupu díky snížení interferencí.
• Celkově delší životnosti iontů po PTCR (nižší kinetická energie, méně kolizí) přispěly k vyššímu počtu měřitelných signálů a lepšímu statistickému podkladu pro přiřazení náboje.

Vliv na sekvenční pokrytí (top-down):

• Bez PTCR byla sekvenční pokrytí bCA II v rozmezí ~21,2–56,2 % pro různé proteoformy, s omezeným pokrytím terminálních oblastí.
• S PTCR se pokrytí zvýšilo na ~39,0–82,9 %, přičemž zlepšení terminálního pokrytí bylo především důsledkem lepší detekce vysokomassových fragmentů.

Přínosy a praktické využití metody

Hlavní přínosy integrace PTCR s Orbitrap-based CDMS:

• Významné zvýšení průchodnosti: více charge-assigned iontů na stejné množství akvizic zkracuje dobu potřebnou k dosažení statisticky robustních výsledků.
• Zvýšená citlivost pro vysokomassové fragmenty zlepšuje mapování proteoformních variant a sekvenční pokrytí v top-down experimentech.
• Zlepšená přesnost přiřazení náboje, zejména u algoritmů založených na centrálních limitech, zvyšuje spolehlivost hmotnostních určení pro heterogenní směsi.
• Delší doby života iontů v analyzátoru po PTCR zlepšují kvalitu jednotlivých měření a redukují nutnost rozsáhlého přeběru spekter.

Praktické aplikace:

• Top-down proteomika a charakterizace proteoformů s vysokou heterogenitou.
• Analýza nativních komplexů a makromolekul, kde je kritická detekce vysokomassových fragmentů.
• Situace, kde je požadována rychlejší statistická agregace dat bez kompromisu v přesnosti hmotnostního určení.

Budoucí trendy a možnosti využití

Možné směry dalšího rozvoje a aplikací:

• Optimalizace délky a podmínek PTCR pro různé typy analyzátů (různé velikosti a heterogenity) a jejich automatizace v analytických metodikách.
• Integrované zpracování dat optimalizované pro zvýšené množství iontů na spektrum, včetně adaptivních filtračních strategií a vylepšených algoritmů pro přiřazení náboje.
• Rozšíření metody na větší proteiny, proteinové komplexy a aduktuální či modifikované proteoformy, včetně studií nativní struktury a dynamiky.
• Možné kombinace s dalšími plynovými reakcemi (např. ETD/PRM hybridní schémata) pro cílené zvýraznění určitých tříd fragmentů.

Závěr

Integrace proton transfer charge reduction s Orbitrap-based CDMS významně zlepšuje průchodnost, citlivost na vysokomassové fragmenty a přesnost přiřazení náboje, což vede k lepšímu sekvenčnímu pokrytí v top-down analýzách. PTCR snižuje spektroskopickou kongesci přesunem iontů do vyšších m/z oblastí, umožňuje větší počet bezpečně detekovaných iontů na spektrum a zlepšuje výkon algoritmů pro přiřazení náboje. Tyto vlastnosti činí kombinaci PTCR + CDMS atraktivní volbou pro analýzu heterogenních, vysokomolekulárních biomolekul v rutinních i výzkumných aplikacích.

Reference

1. Fuerstenau, S. D.; Benner, W. H. Rapid Communications in Mass Spectrometry 1995, 9, 1528–1538.
2. Stephenson, J. L.; McLuckey, S. A. Journal of the American Chemical Society 1996, 118 (31), 7390–7397.
3. Kafader, J. O.; Durbin, K. R.; Melani, R. D.; Des Soye, B. J.; Schachner, L. F.; Senko, M. W.; Compton, P. D.; Kelleher, N. L. Journal of Proteome Research 2020, 19 (3), 1346–1350.