Decipher intricate glycoproteins using data-independent acquisition-proton transfer charge reduction and native top-down mass spectrometry

Význam tématu

Massová spektrometrie nativních proteomů včetně postupů data-independent acquisition proton transfer charge reduction (DIA-PTCR) a nativního top-down MS představuje zásadní krok pro detailní charakterizaci glykoproteinů. Podrobné mapování glykosylace virů, jako je SARS-CoV-2, je klíčové pro vývoj vakcín a terapeutik, neboť PTM modifikace ovlivňují afinitu k receptorům a imunitní rozpoznání.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat kombinaci DIA-PTCR s nativním top-down MS na platformách Thermo Scientific Orbitrap Tribrid (Ascend a Eclipse) pro:

• rozlišení složitých proteoform glykoproteinu fetuin (hFet),
• charakterizaci nukleokapsidového proteinu (Nc) a receptor-binding domény (RBD) spike proteinu SARS-CoV-2,
• určení globálního profilu glykosylace celého spike trimeru.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorků byla použita 200 mM roztok amoniakálního octanu a buffer exchange pomocí Amicon Ultra filtrů. Analýzy probíhaly na:

• Thermo Scientific Orbitrap Ascend Structural Biology Tribrid MS (MS1, DIA-PTCR),
• Thermo Scientific Orbitrap Eclipse Tribrid MS (nativní top-down ETD/EThcD/HCD),
• software Thermo Scientific BioPharma Finder 5.0 pro dekonvoluci a přiřazení proteoform.

Hlavní výsledky a diskuse

• hFet: DIA-PTCR přidalo k původním 29 MS1 přiřazením přes 300 proteoform, zlepšilo separaci nabíjecích stavů a S/N díky kvadrupólové izolaci a PTCR. Top-down ETD prokázalo připojení řetězců disulfidovou vazbou (C32–C358).
• Nc protein: DIA-PTCR odhalilo monomerní (49 kDa) a dimerní formy (∼100 kDa) s adukty a potenciálními PTM. Top-down ETD identifikovalo N-terminální tajný tag (3 686,68 Da) a odhalilo flexibilní N-terminus a dimerizační C-terminus.
• RBD: Po štěpení N-glykanů PNGase F klesla střední hmotnost z ∼31,8 kDa na 27,6 kDa (zničení Hex9HexNAc10dHex3). DIA-PTCR při rozlišení 480 000 umožnilo přiřazení hlavních O-glykosylací a dvou sekvenčních variant s posunem +70 Da.
• Spike protein (S): Díky DIA-PTCR (5 Th izolace + 5 ms PTCR) se monomer 160–200 kDa jasně dekonvolvoval, odhalily se trimerní formy a nečistoty (70 a 144 kDa).

Přínosy a praktické využití metody

Spojení DIA-PTCR se nativním top-down MS poskytuje rychlé a přesné stanovení hmotnostních profilů vysoce heterogenních glykoproteinů, umožňuje detailní mapování PTM a strukturu proteoform bez nutnosti digesce. Metoda usnadňuje charakterizaci bioterapeutik, virových antigenních cílů a monitorování kvality ve farmaceutickém vývoji.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření vysokorozlišovací DIA-PTCR na celoprotomické analýzy buněčných lyzátů a časově rozlišenou kinetiku PTM. Integrace s umělou inteligencí pro automatizované přiřazování proteoform a propojení s ion mobility MS posílí strukturálně-funkční interpretaci.

Závěr

Studie prokázala, že rozšířená kvadrupólová izolace a PTCR významně zlepšují selektivitu, citlivost a rozlišení proteoform glykoproteinů. Komplexní workflow DIA-PTCR plus nativní top-down MS umožňuje detailní charakterizaci PTM, struktury a heterogenity glykoproteinů způsobem, který je náročný pro běžné techniky.

Reference

1. Huguet R., et al. Proton transfer charge reduction enables high-throughput top-down analysis of large proteoforms. Analytical Chemistry 2019, 91(24):15732–15739.
2. Schachner L.F., et al. Exposing the molecular heterogeneity of glycosylated biotherapeutics. Nature Communications 2024, 15(1):3259.