Proton transfer charge reduction (PTCR)

Význam tématu

Middle-down hmotnostní spektrometrie (MD MS) se stává klíčovou metodou pro detailní analýzu monoklonálních protilátek a jejich subjednotek díky optimálnímu kompromisu mezi bottom-up a top-down přístupy.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo porovnat standardní ETD MS2 se sekvenční ETD MS2 následovanou protonovým přenosem náboje (PTCR MS3) za účelem zvýšení pokrytí sekvence a zlepšení spolehlivosti při identifikaci subjednotek mAb.

1. Stanovit optimální podmínky ETD MS2 a PTCR MS3 na Orbitrap Eclipse Tribrid.
2. Umožnit detailní sekvenování IgG1 fragmentů (Lc, Fd', Fc/2) po IdeS trávení.
3. Ověřit zjednodušení spektra a rozšíření hmotnostního rozsahu pomocí HMRn až do m/z 8000.
4. Navrhnout obecný protokol pro charakterizaci mAb a ADC kombinací aktivací iontů a PTCR.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek standardní mAb SILuLite byl zpracován IdeS proteázou a redukován TCEP, čímž vznikly tři ~25 kDa subjednotky (Lc, Fd', Fc/2). Subjednotky byly separovány na RP UHPLC kolóně MAbPac RP (1.0×150 mm, 4 μm) s nelineárním gradientem a analyzovány na Orbitrap Eclipse Tribrid MS s ETD a PTCR moduly. MS parametry: ETD reakce 3 ms (MS2), PTCR 20–40 ms (MS3), HMRn až do m/z 8000.

Hlavní výsledky a diskuse

• ETD MS2 dosáhla ~46 % pokrytí sekvence Lc jednou analýzou; PTCR MS3 zlepšila pokrytí na 64 %.
• Počet identifikovaných unikátních produktových iontů vzrostl z 110 (ETD MS2) na 212 (ETD MS2–PTCR MS3).
• Počet c/z komplementárních párů se zvýšil z 3 na 53, což výrazně zvyšuje důvěru při lokalizaci PTM.
• Spektrální zjednodušení díky PTCR umožňuje odlišení velkých fragmentů (10–20 kDa) a minimalizuje překryvy nabitých clusterů.

Přínosy a praktické využití metody

• Zrychlené a spolehlivé middle-down sekvenování subjednotek mAb v jediném LC průběhu.
• Vysoké pokrytí sekvence (>60 %) bez nutnosti kombinace více ionizačních metod.
• Zlepšení lokalizace post-translačních modifikací díky identifikaci větších iontů.
• Kompatibilita s analýzou chemických modifikací a konjugovaných protilátek (ADC).

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření principu PTCR na další iontové aktivace (CID, HCD, EThcD, UVPD) ke zvýšení celkového pokrytí sekvence.
• Integrace middle-down přístupu s bioinformatickými nástroji pro automatizované ověřování a kvantifikaci modifikací.
• Možné aplikace v QC prostředí farmaceutického vývoje a v klinické analýze protilátek.

Závěr

Protonový přenos náboje (PTCR) v kombinaci s ETD na Orbitrap Eclipse výrazně zvyšuje kvalitu a hloubku middle-down analýzy monoklonálních protilátek, zvyšuje pokrytí sekvence, zjednodušuje spektra a posiluje důvěru v lokalizaci modifikací v průmyslovém i výzkumném prostředí.

Reference

1. Srzentić K. et al. Interlaboratory Study for Characterizing Monoclonal Antibodies by Top-Down and Middle-Down Mass Spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom 31, 1783–1802 (2020).
2. Fornelli L. et al. Middle-Down Analysis of Monoclonal Antibodies with Electron Transfer Dissociation Orbitrap FTMS. Anal Chem 86, 3005–3012 (2014).
3. Fornelli L. et al. Accurate Sequence Analysis of a Monoclonal Antibody by Top-Down and Middle-Down Orbitrap Mass Spectrometry. Anal Chem 90, 8421–8429 (2018).
4. Kline J. T. et al. Sequential Ion–Ion Reactions for Enhanced Gas-Phase Sequencing of Large Intact Proteins. J Am Soc Mass Spectrom (2021).