The Role of Multi-Angle Light Scattering in Biosimilar Characterization and Approval

Význam tématu

Charakterizace bioterapeutik a biosimilárních produktů je klíčová pro zajištění bezpečnosti, účinnosti a konzistence léčiv v průběhu výroby a po uvedení na trh. Metody, které umožňují absolutní určení molární hmotnosti, detekci agregátů a přesnou kvantifikaci variant velikosti a náboje v nativních formulacích, mají zásadní význam pro rozhodování v regulačních procesech, změnách výrobních postupů a při posuzování biosimilarity.

Cíle a přehled studie / článku

Souhrn publikačních případů prezentuje použití multi-úhlového rozptylu světla (MALS) v kombinaci s chromatografií pro komplexní charakterizaci monoklonálních protilátek a biosimilárních produktů. Cílem je ukázat, jak SEC-MALS a CEX-MALS podporují: potvrzení molární hmotnosti, vyhodnocení agregace a štěpení, porovnání před a po změně buněčné linky u post-approval produktu, doložení podobnosti mezi vyvíjeným biosimilarem a referenčními přípravky a srovnání stability komerčně dostupných formulací za vynucených podmínek degradace.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Size-exclusion chromatography coupled with multi-angle light scattering (SEC-MALS) v kombinaci s diferenciálním refraktometrickým (dRI) a UV280 detekčním systémem pro absolutní stanovení molární hmotnosti hlavního piku, HMWS a LMWS.
• Cation-exchange chromatography (CEX) následovaná MALS (CEX-MALS) pro měření molární hmotnosti separovaných nabitých izoform a identifikaci možných degradačních drah.
• Forcované degradační studie zahrnující tepelné, chemické (různá pH) a mechanické (agitace) stresy s časovými body pro sledování kinetiky agregace a změn konformace.
• Integrace dRI a UV signálů pro empirické určení extinkčních koeficientů vzorků.

Použitá instrumentace:

• DAWN MALS fotometr pro multi-úhlové měření rozptylu a absolutní molární hmotnosti v roztoku.
• Arc Premier HPLC (Waters) jako spolehlivý LC systém pro SEC a CEX separace.
• MaxPeak Premier SEC kolony pro reprodukovatelné velikostní separace.
• dRI detektor a UV280 detektor pro kvantitativní měření refrakčního indexu a absorpce při 280 nm.
• ASTRA software pro zpracování MALS dat a Empower pro HPLC-SEC řízení a správu dat v souladu s požadavky na validaci a auditovatelnost.

Hlavní výsledky a diskuse

- Při posuzování změny buněčné linky (přechod CHO-K1S → CHOK1SV GS-KO) u biosimilárního bevacizumabu (IBI305) SEC-MALS ukázal, že monomerní molární hmotnosti a obsah monomeru se po změně výrazně neliší od pre-change výrobků ani od referenčního produktu; hlavní odchylky byly minoritní a v rozsahu analytické variability.

- CEX-MALS umožnil měřit molární hmotnost jednotlivých nábojových izoform a tím lépe porozumět možným mechanismům degradace a vazby mezi variantami náboje a tendencí k agregaci.

- Při komparativní charakterizaci SB17 (biosimilar ustekinumabu) SEC-MALS s dRI poskytl objektivní data o rozdělení molárních hmotností a procentuálním zastoupení HMWS/LMWS i empirických extinkčních koeficientech, což posílilo argumentaci o podobnosti k referenčním produktům z EU i USA. Tyto výsledky byly součástí podkladů vedoucích k registraci SB17 v USA v roce 2024.

- Studie stability porovnávající dvě komerční biosimilární formulace a referenční Avastin ukázala, že krátkodobé vystavení vysoké teplotě (50 °C) vedlo k nárůstu agregátů až po několika dnech, zatímco mechanická agitace indukovala rychlé a významné konformační změny během 24 hodin. Tyto změny byly průkazné v SEC-MALS profilech jako nárůst dimerských a trimerských oligomerních forem.

- Všechny případy ukazují, že MALS přináší nezávislé a absolutní měření molární hmotnosti, méně náchylné k systematickým chybám vyplývajícím z kalibrace sloupců, a poskytuje důležité informace o složení populací částic v nativních formulacích.

Přínosy a praktické využití metody

• SEC-MALS/CEX-MALS umožňuje regulatorně relevantní, kvantitativní posouzení agregace, fragmentace a monomerického stavu bez nutnosti standardů pro kalibraci molární hmotnosti.
• Metoda podporuje rozhodování při změnách výrobního procesu (post-approval changes) tím, že detekuje i jemné rozdíly ve velikostních a nábojových variantách, které by mohly ovlivnit kvalitu produktu.
• Integrace dRI a UV dat dává možnost empirického určení extinkčních koeficientů, což zvyšuje přesnost kvantifikace proteinů a zlepšuje srovnatelnost mezi šaržemi a produkty.
• Forcované degradační studie s MALS dávají přímé informace o kinetice agregace a o tom, které stresory (teplo, pH, agitace) nejvíce ohrožují stabilitu formulace, což informuje výběr excipientů (např. typ polysorbátu) a podmínek skladování.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření aplikací MALS v kombinaci s dalšími separačními a strukturními technikami (např. LC–MS, kapilární elektroforézou, H/D výměnovou hmotnostní spektrometrií) pro komplexnější mapování heterogenity a lokalizaci modifikací.
• Automatizace a standardizace SEC-MALS workflows napříč laboratořemi a lokacemi k podpoře multiplatformní reprodukovatelnosti při regulačních podáních.
• Rozvoj softwaru pro lepší integraci dat, automatické posuzování shody a robustní reportování výsledků v kontextu kvality produktu a rizikových atributů.
• Větší využití MALS pro charakterizaci nových tříd biologik, konjugátů, nanoterapeutik a složitých směsí, kde kalibrační metody selhávají.

Závěr

SEC-MALS a příbuzné MALS aplikace představují silný analytický nástroj pro absolutní určení molární hmotnosti a kvantifikaci velikostních a nábojových variant u bioterapeutik. Příklady uvedené v publikacích demonstrují, že MALS zásadně přispívá k podkladům pro regulatorní rozhodování při změnách výrobních procesů, dokládání biosimilarity a hodnocení stability formulací. Implementace SEC-MALS do analytického panelu zvyšuje důvěru v posuzování kvality a konzistence biologických léčiv.

Reference

1. Wu Z., et al. Comparability strategy and demonstration for post-approval production cell line change of a bevacizumab biosimilar IBI305. Antibody Therapeutics. 2023;6(3):194–210.
2. Yang S.Y., et al. Characterization for the similarity assessment between the proposed biosimilar SB17 and ustekinumab reference product using state-of-the-art analytical methods. Analytical Methods. Drugs R D. 2025.
3. Bana A.A., et al. Comparative stability study and aggregate analysis of Bevacizumab marketed formulations using advanced analytical techniques. Heliyon. 2023;9(9):e19478.
4. Genentech. How is Avastin designed to work? 2025. (zdroj informací o mechanismu účinku Avastinu).
5. Janssen Biotech, Inc. How Stelara Works. 2024. (informace o mechanismu ustekinumabu).
6. Samsung Bioepis. News release regarding SB17 approval. 2024.