WHAT’S INSIDE A VACCINE? A CLOSER LOOK USING CHARGE DETECTION MASS SPECTROMETRY

Shrnutí: WHAT’S INSIDE A VACCINE? — Podrobná charakterizace pomocí Charge Detection Mass Spectrometry (CDMS)

Význam tématu

V současném vývoji vakcín roste zájem o velké a heterogenní biologické platformy — virus-like particles (VLP), inaktivované viry a nanopartikulární nosiče. Tyto struktury často přesahují kapacity konvenčních hmotnostních metod kvůli vysoké hmotnosti, heterogenitě a širokému rozptylu nábojových stavů. Přímé a spolehlivé určování hmotnosti jednotlivých částic je klíčové pro kvalitu, bezpečnost a účinnost vakcín, pro odhalení defektů a pro optimalizaci výrobních procesů. CDMS nabízí možnost měřit m/z a náboj nezávisle pro jednotlivé ionty, čímž eliminuje potřebu dekonvoluce nábojových stavů a umožňuje analýzu velmi velkých komplexů v jednotlivých kusech.

Cíle a přehled studie

Cílem prezentované práce bylo demonstrovat schopnost přístroje Xevo ELIT-based CDMS charakterizovat komerční vakcíny a rekombinantní VLPs. Studie se zaměřila na příklady z praxe: Engerix-B (HBsAg VLPy), RotaTeq (rotavirus), IPOL (inaktivovaná poliovirová vakcína) a sbírku rekombinantních VLP (Dengue 1–4, Norovirus G1.I/ G1.II, Chikungunya). Hlavním záměrem bylo ukázat přímé určení hmotnostních distribucí, detekci subčástic, prázdných vs. plných částic a nečistot ve formulacích vakcín.

Použitá metodika

Analýza probíhala v pozitivním režimu pomocí statické nanoelektrospray ionizace (nanoESI). Vzorky byly přebufferovány do 200 mM roztoku amonného acetátu pomocí spin kolon (Micro Bio-Spin P-6) nebo Amicon filtrů (100 kDa) k odstranění nadbytečných solutů. Ionty byly zachyceny v elektrostatickém lineárním iontovém pasti (ELIT) a oscilace iontu v detekčním válci byla transformována Fourierovou transformací (FFT) pro získání m/z; velikost signálu odpovídala měřenému náboji. Typické experimentální parametry zahrnovaly dobu zachycení ~100 ms a výpočtem byl získán náboj s RMSD ~0.9 e. Data byla zpracována a vizualizována softwarem CDMS Toolkit / waters_connect, přičemž jednotlivé ionty byly binovány pro vytvoření histogramů m/z, náboje a výsledného rozdělení hmotnosti.

Použitá instrumentace

• Waters Xevo ELIT-based CDMS (Charge Detection Mass Spectrometer s elektrostatickým lineárním iontovým pasem)
• Statické nanoESI emitery pro generování iontů
• Detekční válec s nízkošumovým charge sensitive amplifier pro snímání indukovaného náboje
• FFT zpracování signálu a CDMS Toolkit / waters_connect pro vizualizaci a analýzu
• Přípravné pomůcky: Micro Bio-Spin P-6 size-exclusion columns (Bio-Rad) a Amicon 100 kDa MWCO filtry (Merck Millipore)

Hlavní výsledky a diskuse

• Engerix-B (HBsAg VLP): CDMS detekovalo oligomerické subassemblies a T=1 částice, nicméně výrazné T=3 distribuční pásmo nebylo rozlišeno; 2D grafy hmotnost vs. náboj ilustrovaly heterogenitu populací a přítomnost subčástic.
• RotaTeq (rotavirus): zachycen byl rotavirus double layered particle (DLP) s naměřenou hmotností 61.07 MDa (odchylka -1.75 %, FWHM ~0.95 MDa) a širokým rozsahem m/z 80 000–200 000. To potvrzuje schopnost CDMS měřit velmi velké komplexy v rámci rozumného časového okna (30 min, ~6700 iontů).
• IPOL (poliovirová vakcína): zobrazeny byly dvě populace odpovídající prázdným (C-antigen) a plným (D-antigen) částicím s naměřenými hmotnostmi 5.98 MDa (+1.53 %) a 8.62 MDa (+2.25 %). Studie odhalila i defektní/nezkompletněné částice a nečistoty.
• Rekombinantní VLPs: Norovirus a Chikungunya prokázaly klasické kapsidové struktury odpovídající očekávaným hmotnostem; Dengue serotypy vykazovaly především subviral assemblies místo kompletních kapsid.

Diskuse se věnovala faktorům ovlivňujícím naměřenou hmotnost: přítomnosti kontraiontů, nedokonale odstraněným solutům, vázanému rozpouštědlu a formaldehydové crosslinkaci ve formulacích, které mohou zvyšovat naměřenou hmotnost o několik procent. Studie rovněž ilustrovala, že některé formulace mohou maskovat plné částice nebo ovlivňovat ionizaci, což vede k malé nebo žádné detekci očekávaných forem (např. chybějící T=3 u Engerix-B).

Přínosy a praktické využití metody

• CDMS poskytuje přímé, jednopartikulové měření hmotnosti bez potřeby dekonvoluce nábojových stavů, což je zásadní pro vysoce heterogenní a velmi hmotné biologické komplexy.
• Umožňuje rozlišit prázdné a plné částice, odhalit subassemblies, defektní partikule a adukty, což je užitečné pro QC a vývoj vakcín.
• Rychlost a senzitivita: praktické doby akvizice (řád desítek minut) a tisíce–desítky tisíc analyzovaných iontů umožňují efektivní screening formulací a porovnání vzorků.
• Metoda je vhodná pro analýzu velkých virových částic a VLP, kde tradiční MS a jiné techniky selhávají nebo poskytují nejednoznačné výsledky.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Zvýšení propustnosti a automatizace: integrace s robotizovanou přípravou vzorků a automatizovaným zpracováním dat pro rutinní QC.
• Zlepšení rozlišení a přesnosti: optimalizace zachytávání iontů, delší doby měření a pokročilejších signálových algoritmů pro snížení RMSD náboje a zúžení FWHM.
• Komplementární multimodální analýzy: kombinace CDMS s technikami jako NES-GEMMA, cryo-EM, AUC nebo kapilární elektroforézou pro komplexní charakterizaci struktury, velikosti a složení částic.
• Standardizace a kvantitativní metody: vývoj kalibrací, interních standardů a statistických přístupů pro spolehlivou kvantifikaci poměrů prázdné/plné a obsahu antigenů ve formulaci.
• Regulační akceptace: etablování CDMS v rámci validovaných analytických metod pro uplatnění ve farmaceutickém průmyslu a při registraci vakcín.

Závěr

Studie demonstruje, že ELIT-based CDMS (Xevo) je silným nástrojem pro přímou analýzu hmotnosti jednotlivých virových antigenů a VLP v komerčních vakcínách. Metoda poskytuje cenné informace o heterogenitě populací, přítomnosti subassemblies, plných a prázdných částicách a nečistotách, přičemž měření obvykle vykazují shodu v rámci několika procent s očekávanými hodnotami po zohlednění aduktů a kontraiontů. CDMS má vysoký potenciál pro rozšířené využití ve vývoji vakcín a v kontrolách kvality, zejména pro systémy, které jsou mimo dosah tradičních hmotnostních metod.

Reference

1. Haris A.; Christofi E.; Eatough D.; D’Esposito R. J.; Bruton D.; Richardson K.; Ujma J.; Yu Y. Q.; Giles K. Characterization with Relative Quantitation of Adeno-Associated Viruses (AAVs) Using Xevo Charge Detection Mass Spectrometry (CDMS); Waters Corporation: Milford, MA, 2025.
2. Barnes L. F.; Draper B. E.; Jarrold M. F. Analysis of Recombinant Adenovirus Vectors by Ion Trap Charge Detection Mass Spectrometry: Accurate Molecular Weight Measurements beyond 150 MDa. Analytical Chemistry 2022, 94 (3), 1543–1551.
3. Miller L. M.; Bond K. M.; Draper B. E.; Jarrold M. F. Characterization of Classical Vaccines by Charge Detection Mass Spectrometry. Analytical Chemistry 2021, 93 (35), 11965–11972.
4. Weiss V. U.; Pogan R.; Zoratto S.; Bond K. M.; Boulanger P.; Jarrold M. F.; Lyktey N.; Pahl D.; Puffler N.; Schelhaas M.; Selivanovitch E.; Uetrecht C.; Allmaier G. Virus-like Particle Size and Molecular Weight/Mass Determination Applying Gas-Phase Electrophoresis (Native NES GEMMA). Analytical and Bioanalytical Chemistry 2019, 411 (23), 5951–5962.