Virus-Like Particle Characterization by SECMALS Using a GTxResolve Premier SEC 1000 Å 3 μm Column

Význam tématu

Virus-like particles (VLP) představují klíčovou platformu pro vývoj vakcín díky své schopnosti prezentovat antigeny bez infekčního genomu. Precizní charakterizace VLP je zásadní pro zajištění jejich bezpečnosti, účinnosti a reprodukovatelnosti ve vývoji nových imunizací.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této studie bylo porovnat výkon kolony GTxResolve Premier SEC 1000 Å 3 µm se standardní SEC kolónou (1000 Å, 2,7 µm) při analýze Qβ VLP. Metoda SEC hyphenovaná s MALS/UV/RI umožňuje stanovit čistotu, složení, molární hmotnost a velikost částic VLP.

Použitá metodika a instrumentace

• Kolony: GTxResolve Premier SEC 1000 Å, 3 µm, 4,6×300 mm a konkurenční SEC 1000 Å, 2,7 µm.
• Chromatograf: Arc Premier System s QSM a SM-FTN (Waters).
• Detekce: DAWN MALS s QELS modulem, Arc Premier UV/Vis (2489) při 260 a 280 nm, Optilab dRI.
• Software: Empower CDS verze 3.8.0 pro řízení LC a ASTRA 8 pro analýzu MALS dat.
• Mobilní fáze: Dulbecco’s PBS 1× a 2×, filtrované 0,1 µm.
• Podmínky: teplota kolony 30 °C, vzorků 6 °C, průtok 0,4 a 0,1 mL/min, inj. objem 20 µL.

Hlavní výsledky a diskuse

• Kolona GTxResolve dosáhla vyšších výtěžků agregátů (Peak 1: 20,7 % vs 8,2 %) a lepší rozlišení mezi monomerními a menšími formami (Peak 3 vs Peak 4) než konkurent.
• SEC-MALS identifikovala čtyři hlavní chromatografické frakce: agregáty, dimery, monomery (T=3, 180 CP, 2,0–3,4 MDa) a malou formu (T=1, 60 CP, 1,4–1,7 MDa).
• Hydrodynamické a gyrace radiusy podpořily morfologii částic: Rg/Rh ~0,74 pro globulární T=3 a ~0,94–0,97 pro prodloužené agregáty.
• Snížení průtoku na 0,1 mL/min zlepšilo separaci vnitřních isoform v Peak 3 a zvýšilo rozlišení T=1 formy.

Přínosy a praktické využití metody

• SEC-MALS s GTxResolve Premier kolónou umožňuje komplexní QC VLP vakcín a biologických přípravků.
• Metoda nabízí rychlou a reprodukovatelnou analýzu purity, polydisperzity a biochemických atributů v procesu vývoje i výrobě.
• Snadné přizpůsobení metodiky optimalizací průtoku a mobilní fáze pro různé VLP systémy.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další vylepšení stacionární fáze pro minimalizaci sekundárních interakcí a zvýšení účinnosti separace.
• Integrace SEC-MALS s hmotnostní spektrometrií (SEC-MS) pro detailní charakterizaci proteoform.
• Automatizace a miniaturizace pro vysokopropustné screeningové aplikace a multiplatformní analýzy.
• Kombinace s cryo-EM a kapilárními technikami pro strukturální validaci a interdisciplinární výzkum VLP.

Závěr

Kolona GTxResolve Premier SEC 1000 Å 3 µm prokázala vynikající rozlišení, vyšší recovery agregátů a přesné stanovení biofyzikálních parametrů Qβ VLP ve srovnání s běžnou SEC kolónou. Metoda SEC-MALS tak poskytuje spolehlivý nástroj pro charakterizaci VLP a podporuje rozhodování ve vývoji vakcín.

Reference

1. Kheirvari M. et al. Virus-like Particle Vaccines and Platforms for Vaccine Development. Viruses. 2023;15(5):1109. doi:10.3390/v15051109.
2. Camacho K.J. et al. Bridged Ethylene Polyethylene Oxide Surfaces to Improve Packing Materials. J. Sep. Sci. 2024;47(20). doi:10.1002/jssc.202400541.
3. Finny A.S. et al. Enhancing Size-Exclusion Chromatography of Large Biomolecular Analytes. Waters Corp. 2024.
4. He J. et al. Virus-like Particles as Nanocarriers for Intracellular Delivery. Viruses. 2022;14(9):1905. doi:10.3390/v14091905.
5. Maphis N.M. et al. Qß Virus-like Particle Vaccine Induces Robust Immunity. npj Vaccines. 2019. doi:10.1038/s41541-019-0118-4.
6. Chang J.-Y. et al. Structural Assembly of Qβ Virion and Its Diverse Forms. Viruses. 2022;14(2):225. doi:10.3390/v14020225.
7. Sungsuwan S. et al. Evaluation of Virus-Like Particle-Based Tumor-Associated Immunogen. Methods Protoc. 2017;1:18. doi:10.1016/bs.mie.2017.06.030.
8. Parikh R.A. et al. Coupling of SEC to Charge Detection MS for VLP Analysis. Anal. Chem. 2025. doi:10.1021/acs.analchem.4c06084.
9. Singleton R.L. et al. Function of the RNA Coliphage Qβ Proteins in In Vitro Evolution. Methods Protoc. 2018;1(2):18. doi:10.3390/mps1020018.
10. Wyatt P.J. Light Scattering and the Absolute Characterization of Macromolecules. Anal. Chim. Acta. 1993;272:1–40. doi:10.1016/0003-2670(93)80373-S.
11. Zeltins A. Construction and Characterization of Virus-Like Particles: A Review. Mol. Biotechnol. 2013;53:92–107. doi:10.1007/s12033-012-9598-4.
12. Mejía-Méndez J.L. et al. Virus-like Particles: Fundamentals and Biomedical Applications. Int. J. Mol. Sci. 2022;23(15):8579. doi:10.3390/ijms23158579.