ANALYTICAL REPEATABILITY AND PRECISION OF THE XEVO CDMS SYSTEM FOR AAV CAPSID CHARACTERIZATION

Význam tématu

Rekombinantní adeno-asociované viry (AAV) jsou klíčovými nosiči genové terapie, přičemž terapeutický efekt závisí především na podílu částic obsahujících genom (full capsids). Přítomnost prázdných, částečně zaplněných nebo nadbytečně naplněných částic snižuje efektivní dávku a zvyšuje riziko imunogenicity. Proto je přesná a reprodukovatelná kvantifikace jednotlivých populací kapsid nezbytná pro vývoj procesů, porovnávání šarží a rozhodování v oblasti CMC (Chemistry, Manufacturing, and Controls). Charge detection mass spectrometry (CDMS) nabízí přímé měření hmotnosti jednotlivých částic bez nutnosti dekonvoluce nábojových stavů, což ji činí atraktivní pro analýzu heterogenních virálních preparátů.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo ověřit analytickou opakovatelnost, mezidenní přesnost a provozní robustnost systému Xevo CDMS při charakterizaci AAV kapsid za podmínek vysokopropustného provozu a v rozsahu koncentrací relevantních pro vývoj a výrobu. Studie hodnotila: opakovatelnost opakovaných injekcí (12 injekcí/den po dobu pěti dnů), reproducibilitu při střídání koncentrací reprezentujících upstream (1 × 10^11 vp/mL) a downstream (5 × 10^12 vp/mL) procesy a přesnost měření hmotnosti a relativní kvantifikace prázdných/naplněných/overfull populací.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorky: komerčně dodané AAV8 (CMV-GFP) prázdné a plné kapsidy (Virovek Inc.), původní koncentrace 2 × 10^13 vp/mL; buffer exchange do 200 mM ammonium acetate s 0,01 % Pluronic F-68.
• Příprava směsí: 1:1 směs Empty:Full, ředěná na 1 × 10^13 vp/mL (test opakovatelnosti), dále na 5 × 10^12 vp/mL a 1 × 10^11 vp/mL pro testy robustnosti.
• Analytika: Xevo CDMS (Waters) s nano-elektrospray v pozitivním módu; ionty byly zachytávány v detekčním válci po dobu 100 ms. Akvizice ~30 minut na získání ~5000 iontů na běh. Signály zpracovány Fourierovou transformací pro určení frekvence (m/z) a amplitudy (z), následně vypočtena hmotnost každé částice jako m = (m/z) × z.
• Software: Waters_Connect pro zpracování signálu a vizualizaci dat.
• Struktura CDMS detektoru: vodivý válec s dvěma ionovými zrcadly, která ionty odrážejí tam a zpět; indukovaný náboj detekován nízkošumovým zesilovačem a analyzován FFT.

Hlavní výsledky a diskuse

• Opakovatelnost: 12 injekcí denně po dobu pěti dnů na 1:1 směsi Empty/Full ukázalo relativní abundanci s RSD <2 % a všechny injekce byly v rozmezí ±3 % od průměru, což indikuje velmi stabilní kvantifikaci mezi běhy.
• Mezidenní přesnost hmotnosti: průměrné naměřené hmotnosti jednotlivých populací vykazovaly RSD <1 % napříč pěti dny a všechny hodnoty ležely v ±3 % od celkového průměru, tedy vysoce reprodukovatelné pro rozhodování o tom, které částice jsou „full“ vs. „empty“.
• Robustnost napříč koncentracemi: při střídání nízké (1 × 10^11 vp/mL) a vysoké (5 × 10^12 vp/mL) koncentrace zůstávala relativní kvantifikace pod předem stanoveným limitem RSD 5 %; to potvrzuje odolnost metody vůči změnám titru a pořadí injekcí.
• Datová kvalita a throughput: 95% first-pass success rate redukuje potřebu opakování injekcí, 99% usable data rate poskytuje konzistentní průběh analýz vhodný pro QC a vývoj.
• Interpretace grafů: normalizovaná hmotnostní rozdělení demonstrovala stabilitu tvaru a polohy hlavních populací během pětidenního experimentu; průměrné hmotnosti a složení populací při obou koncentracích vykazovaly malé variace, což podporuje spolehlivost CDMS pro relativní i absolutní měření.

Přínosy a praktické využití metody

• CDMS umožňuje přímé měření hmotnosti jednotlivých virionů bez dekonvoluce nábojů, čímž eliminuje některé zdroje systematické chyby běžné u jiných MS přístupů.
• Vysoká přesnost hmotnosti (<1 % RSD) umožňuje jasné rozlišení prázdných, plných a overfull částic, což přímo podporuje přesné dávkování a kontrolu kvality léčivých přípravků na bázi AAV.
• Demonstrace stability napříč dny a při různých titrech ukazuje, že systém je použitelný pro rutinní monitorování výrobního procesu, porovnávání šarží a CMC dokumentaci.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace CDMS do standardních QC workflow pro genovou terapii, zejména tam, kde je potřeba vysoká přesnost při vyhodnocení podílů funkcionality v populaci částic.
• Další optimalizace pro zvýšení propustnosti a automatizace přípravy vzorků (např. robotické ředění, automatické buffer exchange) by mohla dále rozšířit použití v kontrolovaných výrobních prostředích.
• Rozšíření aplikací CDMS na jiné virové vektory a nanopartikulární systémy, kde je heterogenita hmotnosti kritická, včetně kombinace s orthogonalními metodami (ELISA, AUC, TEM) pro komplexní charakterizaci produktů.
• Technologické vylepšení detekce a zpracování signálu by mohlo snížit dobu akvizice potřebnou k získání statisticky významného počtu iontů, což by zlepšilo throughput bez kompromisu na kvalitě dat.

Závěr

Studie demonstruje, že Xevo CDMS poskytuje vysoce přesná a reprodukovatelná měření AAV kapsid: hmotnostní přesnost pod 1 % RSD, stabilní relativní kvantifikaci s variabilitou pod 2–5 % RSD a vysokou datovou využitelnost (≈99 %) s nízkou potřebou opakování (95 % first-pass success). Tyto vlastnosti dělají z CDMS vhodný nástroj pro rutinní monitorování procesu, porovnávání šarží a podporu CMC rozhodování při vývoji a výrobě AAV vektorů.

Reference

• Christofi E., Haris A., McDonald S.; Waters Corporation. Analytical repeatability and precision of the Xevo CDMS system for AAV capsid characterization. Poster 720009420EN (2026).