End-to-End High-Throughput Biotransformation Workflow: Automated Data Acquisition and Processing of Sub-Second UPLC Peaks Using Multi-Reflecting Time-of-Flight Mass Spectrometry and Dedicated Data-Mining Tools

Význam tématu

Rychlé a spolehlivé mapování biotransformací léků je klíčové pro farmacokinetiku, bezpečnostní hodnocení a vývoj nových látek. Kombinace ultra‑rychlé UPLC chromatografie s vysokorozlišujícím hmotnostním spektrometrem umožňuje dramaticky zvýšit propustnost analytických laboratoří, přičemž zachovává nebo zvyšuje kvalitu identifikace metabolitů. Tato studie demonstruje end‑to‑end workflow pro sub‑sekundové chromatografické píky s automatizovaným získáváním dat a dataminingem, čímž adresuje hlavní úzká místa tradičních UHPLC‑HRMS přístupů (doba běhu, počet datových bodů na píku, manuální zpracování dat).

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo předvést plně integrované, vysokopropustné řešení pro identifikaci metabolitů v reálných biologických vzorcích. Platforma kombinuje krátké UPLC gradienty (90 s), multi‑reflecting TOF MS (Xevo MRT P10) s vysokou frekvencí akvizice (až 100 Hz) a dedikovaný software pro automatizované zpracování dat (MassMetaSite). Testovací aplikací byla identifikace paracetamolových metabolitů v moči psů po intravenózním podání.

Použitá metodika a instrumentace

Krátce shrnuto: příprava vzorků, chromatografie, hmotnostní spektrometrie a zpracování dat.

Vzorky a příprava:

• Biologický model: samci beagle psů; jediná i.v. dávka paracetamolu 10 mg/kg; sběr moči před a 6 h po podání.
• Příprava vzorků: proteinová precipitace metanolem, supernatant zředěn vodou; injekce 2 µL.

Chromatografie:

• Kolona: ACQUITY UPLC HSS T3, 1.8 µm, 2.1 × 50 mm.
• Teplota kolony: 40 °C; průtok: 0.6 mL/min.
• Optimalizované gradienty zkrátily celkový běh z ~45 minut na 90 sekund, což vedlo k sub‑sekundovým píkům.

Hmotnostní spektrometrie a akvizice:

• Systém: Xevo MRT P10 (multi‑reflecting TOF)
• Režim ionizace: ESI pozitivní; rozsah m/z 50–1200.
• Akvizice: DDA (data dependent acquisition); survey skeny 50 Hz (0.02 s), MS/MS skeny 100 Hz (0.01 s).
• Top N: 5; prah pro start MS/MS: 25 000; dynamic exclusion: 1 s; charge state +1 preferováno.
• Lock mass: leucine enkephalin; dosažená RMS přesnost hmotnosti: ~0.727 ppm (≈727 ppb).
• Nastavení zdroje a parametrů (zkráceně): capilární napětí 0.8 kV, konus 30 V, desolvační teplota 600 °C, desolvační plyn 1000 L/h.

Software pro zpracování:

• MassMetaSite (Mass Analytica) pro automatizovanou identifikaci metabolitů a generování strukturálních návrhů z DDA dat.

Etika a konflikt zájmů:

Studie provedena podle interních SOP a v duchu GLP; pracovníci Waters a Mass Analytica a externí konzultant jsou formálně uvedeni s deklarovanými vazbami.

Hlavní výsledky a diskuse

Detekce a identifikace:

• V moči 6 h po i.v. dávek paracetamolu bylo identifikováno šest hlavních metabolitů a také 4‑aminofenol. Identifikované jsou: paracetamol (APAP), acetaminofen‑glukuronid (APAP‑G), acetaminofen‑sulfát (APAP‑S), paracetamol‑cystein konjugát (APAP‑Cys), acetaminofen‑mercapturát (APAP‑Mer) a 3‑thiomethyl metabolit (APAP‑3M); vedle toho PAP (4‑aminofenol).
• Dosažená přesnost měření hmotnosti RMS ~0.727 ppm významně zvyšuje jistotu formulací elementalních a izobarických návrhů a snižuje falešné pozitivy.

Kvantitativní relativní rozdělení (shrnutí ze stolníku):

• Největší relativní podíl oblasti signálu měl APAP‑Cys (~39 %), následují APAP‑G (~21 %), APAP‑S (~18 %) a mateřská látka APAP (~11 %); ostatní metabolity tvoří menší část.

Datová kvalita a akvizice:

• Díky vysokým akvizičním frekvencím (50/100 Hz) bylo dosaženo dostatečného počtu datových bodů i pro chromatografické píky kratší než 1 s, což je zásadní pro spolehlivou integraci, deisotopickou analýzu a vzorkování fragmentačních spekter.
• DDA při 100 Hz poskytla kvalitní MS/MS spektra pro strukturální potvrdění metabolitů během 90 s běhu.

Automatizace a zpracování:

• Použití MassMetaSite výrazně zkrátilo dobu potřebnou k racionálnímu přiřazení metabolitů a snížilo závislost na manuální revizi, čímž se zvyšuje konzistence výstupů.

Důsledky pro analytickou praxi:

• Snížení doby analýzy z desítek minut na 90 sekund poskytuje zásadně vyšší throughput bez výrazné ztráty informací o struktuře metabolitů.
• Vyšší rychlost však klade nároky na robustnost chromatografické separace, ionizačního zdroje a spolehlivé řízení DDA parametrů, aby se minimalizovaly rizika chybné identifikace při vysokém tempu.

Přínosy a praktické využití metody

Hlavní přínosy:

• Velmi vysoký throughput: ideální pro screening velkého počtu vzorků v ADME studiích, toxikologii a metabolomice.
• Vysoká přesnost hmotnostního měření a frekvence akvizice zlepšují schopnost rozlišit blízce příbuzné látky a poskytnout kvalitní MS/MS spektra i pro úzké píky.
• Automatizované datamining nástroje redukují čas na lidskou kontrolu a snižují subjektivitu interpretací.

Praktické použití:

• Rychlá identifikace známých i neočekávaných metabolitů během preklinického výzkumu.
• Implementace do rutinních workflow farmaceutických CRO a interních ADME oddělení pro zvýšení produktivity.
• Využití v monitoringu expozice a forenzní toxikologii, kde je potřeba vysokého počtu vzorků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Krátkodobé a střednědobé směry rozvoje:

• Integrace strojového učení a pokročilých algoritmů pro automatické anotace MS/MS spekter a prioritizaci kandidátů metabolitů.
• Rozšíření workflow na negativní ionizační mód a širší rozsah biotransformačních studií (konjugáty, reaktivní intermediate, adukty s proteinem).
• Automatizované předzpracování vzorků a vysokopropustné platformy (robotika) propojené s krátkými běhy UPLC pro úplnou automatizaci end‑to‑end.

Dlouhodobé možnosti:

• Nasazení v klinických studiích pro rychlý monitoring metabolitů a terapeutického sledování v reálném čase.
• Standardizace vysokorychlostních metod jako součást regulovaných pracovních postupů, pokud budou potvrzeny reprodukovatelnost a robustnost napříč laboratořemi.

Závěr

Prezentované end‑to‑end řešení spojující sub‑sekundovou UPLC chromatografii, multi‑reflecting TOF s akvizicí až 100 Hz a dedikovaný software umožňuje rychlou a spolehlivou identifikaci metabolitů v komplexních biologických maticích. Workflow demonstroval výrazné zkrácení doby analýzy (90 s vs ~45 min), vysokou přesnost měření (RMS ~0.727 ppm) a schopnost generovat kvalitní MS/MS spektra pro strukturní potvrzení. Automatizované zpracování zvyšuje konzistenci a produktivitu, přičemž hlavní výzvy zůstávají v řízení chromatografické rozlišitelnosti a robustního nastavení DDA parametrů při vysokém tempu.

Reference

• Zamora I, Khoury‑Hollins H, Fontaine F, Lock R, Pickles D, Plumb R, Wilson I. End‑to‑End High‑Throughput Biotransformation Workflow: Automated Data Acquisition and Processing of Sub‑Second UPLC Peaks Using Multi‑Reflecting Time‑of‑Flight Mass Spectrometry and Dedicated Data‑Mining Tools. Waters Corporation / Mass Analytica; 2026. Poster (720009404EN).
• Software: MassMetaSite (Mass Analytica) — použitý nástroj pro automatizovanou identifikaci metabolitů.