Targeted Liquid Chromatography Multi- Reflecting Time-of-Flight Mass Spectrometry for Comprehensive Metabolic Profiling

Význam tématu

Targeted metabolické profilování má zásadní význam v biomedicínském výzkumu, klinické diagnostice a v translaci objevů do praxe. Kvantitativní metody musí zajistit vysokou citlivost a selektivitu pro spolehlivou detekci a měření nízkokoncentrovaných metabolitů v komplexních matricích (např. moč). Pokrok v oblasti vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrie (HRMS), konkrétně víceodrazových time‑of‑flight (MRT) analyzátorů, umožňuje tyto přístroje efektivně využít i pro cílené kvantifikace, čímž se překlenou rozdíly mezi untargeted a targeted přístupy a zvyšuje se analytická flexibilita jednoho pracoviště.

Cíle a přehled studie / článku

Účelem práce bylo demonstrovat pracovní postup Tof MRM (time‑of‑flight multiple reaction monitoring) na přístroji Xevo MRT P10 pro cílenou kvantifikaci přibližně 60 metabolitů v biologické matrici (moč). Studie hodnotila citlivost, selektivitu, lineární rozsah a reprodukovatelnost metody v kontextu multiplexovaného monitorování chemicky rozmanitých sloučenin a porovnala přínosy MRT‑HRMS přístupu vůči konvenčním triple‑quadrupolovým metodám.

Použitá metodika a instrumentace

Postup přípravy vzorků:

• Interní standard: sušený U‑13C metabolitový extrakt z kvasinek byl rekonstituován ve směsi voda:methanol 1:1 (v/v) a použit pro přípravu Working Internal Standard (WIS) smícháním 1 dílu U‑13C extraktu se 4 díly acetonitril:methanol (1:1 v/v).
• Matricová variabilita: komerční pool moči upravený pro různé hodnoty specifické hmotnosti (SG) 1.0097 až 1.0382 pomocí zředění nebo lyofilizace a rekonstituce v odlišných objemech.
• Příprava analytických vzorků: 25 µL moči + 75 µL WIS, vortex 60 s, centrifugace 10 min při 4 °C, přenos 80 µL supernatantu do LC‑MS vialu.

Chromatografie (LC):

• System: ACQUITY Premier UPLC System.
• Kolona: Atlantis Premier BEH Z‑HILIC, 1.7 µm, 2.1 × 150 mm, teplota 40 °C, teplota vzorků 6 °C.
• Objem injekce: 2 µL, průtok 0.35 mL/min.
• Mobilní fáze obsahovala 10 mM acetátu amonného v směnách H2O/ACN; gradient optimalizovaný pro HILIC separaci polárních metabolitů (tabulka gradientu uvedena v původním dokumentu).

Hmotnostní spektrometrie (MS):

• Přístroj: Xevo MRT P10 Mass Spectrometer, režim akvizice Tof MRM s Enhanced Duty Cycle (EDC).
• Ionizace: ESI pozitivní a negativní (36 analyzátů v ES+, 25 v ES‑).
• Nastavení: kapilární napětí 2 kV, desolvační teplota 500 °C, desolvační plyn 800 L/h, cone gas 50 L/h.
• Quadrupolní izolace: jednotkové rozlišení (~1 Da); produktová iontová detekce v režimu vysokého rozlišení (±25 ppm).
• Dwell časy optimalizovány tak, aby se sbíralo ~8–10 datových bodů na chromatografický vrchol; kolizní energie optimalizována pro každou přechodovou dvojici.
• Lock mass: dual‑point použití leucine‑enkephalinu (ES+: m/z 556.27658 a 120.08078; ES‑: m/z 554.26202 a 130.08735).

Software a zpracování dat:

• waters_connect platforma s aplikací MS Quan pro automatickou integraci a kvantifikaci; kalibrační křivky váženy 1/x nebo 1/x2.

Hlavní výsledky a diskuse

Klíčové body výsledků:

• Panel zahrnoval 61 metabolitů z různých tříd (aminokyseliny, organické kyseliny, nukleotidy apod.).
• Jako zdroj fragmentačních iontů byly použity DDA a DIA scouting experimenty; naměřená přesnost hmotnosti fragmentů byla vynikající (<2 ppm), což zvýšilo spolehlivost výběru přechodů pro Tof MRM.
• EDC v MRT‑TOF maximálně zvýšil duty cycle a citlivost, což umožnilo krátké dwell časy při zároveň vysokém počtu přechodů na analýzu.
• Metoda vykázala dobré chromatografické tvary a stabilní retence, umožňující úzká retenční okna (~±30 s) pro jednotlivé přechody.
• Pro většinu sledovaných metabolit byla dosažena vysoká citlivost a lineární odezva v rámci testovaného rozsahu; 48 sloučenin splnilo kritéria pro kvantifikaci s vysokou přesností a opakovatelností (přesnost kalibračních standardů %CV ≤20 %, LLOQ ≤25 %CV).
• Při LLOQ u několika reprezentativních analyzátů bylo dosaženo vysokého poměru signál/šum (>20), i přes nízkou absolutní intenzitu signálu — to ilustruje výhodu HRMS v potlačení matricových interferencí.

Diskuse:
Implementace Tof MRM na MRT‑TOF přístroji kombinuje selektivitu MRM přístupu s výhodami vysokého rozlišení a přesné hmotnosti. To vede ke snížení interferencí z matrice a lepšímu S/N ve srovnání s nominálním‑hmotnostním MRM na triple‑quadrupole. Díky tomu je možné multiplexované sledování širokého panelu metabolitů bez kompromisů v citlivosti, což je užitečné pro klinické a výzkumné aplikace, kde je vyžadována jak kvantifikace, tak možnost pozdějšího netargeted průzkumu na stejném přístroji.

Přínosy a praktické využití metody

Hlavní přínosy:

• Vysoká citlivost a selektivita v komplexních matricích poskytují spolehlivou kvantifikaci nízkokoncentrovaných metabolitů.
• Možnost simultánního provozu cílených a netargetovaných workflow na jednom HRMS zařízení zvyšuje analytickou flexibilitu laboratoře.
• EDC a optimalizované dwell časy umožňují rozšířený multiplex bez ztráty kvality dat.
• Streamlineované zpracování dat (waters_connect + MS Quan) usnadňuje kontrolu kvality a hromadné zpracování velkých panelů.

Praktické využití:

• Klinická metabolomika a biomarkerové studie, kde je potřeba citlivé a specifické kvantifikace.
• Translační výzkum sledující metabolické dráhy v biofluidech (moč, plazma).
• Laboratoře, které chtějí konsolidovat targeted a untargeted analýzy na jedné platformě pro efektivnější workflow.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry vývoje a rozšíření aplikací:

• Dále zvyšování citlivosti a duty cycle MRT‑TOF systémů pro ještě širší multiplexování a nižší LLOQ.
• Integrace rozsáhlejších stabilně značených interních standardů pro zlepšení kvantifikace napříč matricemi a laboratořemi.
• Pokročilé algoritmy pro automatickou selekci přechodů a postprocessing (strojové učení pro dekonvoluci matricových interferencí).
• Rozvoj validací a standardizací metod HRMS‑Tof MRM směrem ke klinické akreditaci a regulovaným aplikacím.
• Větší kombinace targeted panelů s netargeted daty pro komplexní fenotypizaci a objev nových biomarkerů.

Závěr

Prezentovaná aplikace ukazuje, že Tof MRM na Xevo MRT P10 poskytuje vyváženou kombinaci citlivosti, selektivity a průchodnosti pro cílené metabolické panely v komplexních matricích, jako je moč. Technologie MRT‑TOF s Enhanced Duty Cycle umožňuje multiplexované monitorování desítek metabolitů s výsledky, které konkurují tradičním triple‑quadrupolovým metodám, přičemž přidává výhodu vysokého rozlišení a přesné hmotnosti pro snížení matricových interferencí a zvýšení důvěry v identifikace. Tento přístup je vhodný pro aplikace v klinickém výzkumu a translaci, kde je požadavek na citlivou a robustní kvantifikaci spolu s možností širšího analytického průzkumu.

Reference

1. Nagana Gowda GA, Djukovic D. Overview of Mass Spectrometry‑Based Metabolomics: Opportunities and Challenges. Methods Mol Biol. 2014;1198:3–12.
2. Verenchikov et al. A Novel Compact Multi‑Reflecting Time‑of‑Flight Mass Spectrometer. J Am Soc Mass Spectrom. 2026 Mar 4;37(3):601–611.
3. Tomcyzk N, Wallace A, Richardson K, Grzyb A, Wildgoose J. Targeted High Resolution Quantification with Tof‑MRM and HD‑MRM. Application Brief, 2013.
4. Dorrani M et al. Olaris Global Panel (OGP): A Highly Accurate and Reproducible Triple Quadrupole Mass Spectrometry‑Based Metabolomics Method for Clinical Biomarker Discovery. Metabolites. 2024 May 11;14(5):280.