Simultaneous Analysis of 27 Antidiabetic Drugs in Whole Blood by LC–MS/MS

Význam tématu

Současné rozšíření a různorodé klinické i mimoklinické používání antidiabetik (předepsaných i nelegálně získaných) zvyšuje potřebu spolehlivých analytických metod pro stanovení jejich koncentrací v biologických matricích. Předávkování nebo polyfarmacie mohou způsobit těžkou hypoglykémii s následnými závažnými následky, proto je v forenzní a klinické toxikologii klíčové mít rychlé, citlivé a robustní postupy schopné současného kvantitativního stanovení více tříd léků v krevním vzorku.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem prezentované studie bylo vyvinout a ověřit LC–MS/MS metodu umožňující simultánní analýzu 27 antidiabetik v lidské plné krvi v jediném analytickém běhu. Metoda byla navržena tak, aby byla kompatibilní se stávajícím pracovním postupem databáze LC/MS/MS Forensic Toxicology Database, umožňující paralelní analýzu dalších toxikantů.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika zahrnovala extrakci z 100 µL vzorku plné krve pomocí Micro Volume QuEChERS kitu: přidání vody, acetonitrilu a interního standardu (diazepam-d5), míchání, centrifugaci, odparek nad dusíkem a rekonstituci v 20% metanolu. Následná separace a detekce probíhala na LC–MS/MS v režimu MRM.

• Chromatografie: Kinetex XB-C18 (100×2,1 mm, 2,6 µm), 40 °C, objem injekce 1 µL, tok 0,3 mL/min; mobilní fáze voda s 10 mM amonnou solí a 0,1 % kyseliny mravenčí / methanol se stejnou aditivací; časový program %B vycházel z Forensic Toxicology Database.
• MS/MS: Shimadzu LCMS-8050RX (Corespray ESI) v pozitivním ionizačním režimu, režim MRM s individualizovanými prekurzorovými a produktovými ionty a optimalizovanými kolizními energiami pro každou ze 27 sloučenin; diazepam-d5 jako ISTD.
• Parametry ionizace a zdroje: nebulizační, sušící a ohřívací plyn v uvedených průtocích, teploty DL, heat block a rozhraní nastavené pro optimální citlivost.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda úspěšně separovala a detekovala 27 antidiabetik reprezentujících různé chemické třídy (biguanidy, DPP‑4 inhibitory, SGLT2 inhibitory, sulfonylurey, glinidy, thiazolidindiony aj.) v jedné analýze. Retenční časy se pohybovaly přibližně od 0,8 do 8,0 min, což umožnilo kompletní stanovení během zhruba 8 minut.

Validace ukázala vysokou citlivost – všechny látky byly detekovatelné při 0,1 ng/mL v plné krvi. Kalibrační rozsahy se lišily podle látky (nejčastěji 0,1–500 ng/mL; pro některé sloučeniny 0,1–200 nebo 0,1–100 ng/mL). Lineárnost byla velmi dobrá (R2 většinou > 0,995). Při kontrole přesnosti a opakovatelnosti (spiking 20 ng/mL, n = 5) byly výsledky v rozsahu přesnosti 80–120 % a relativní směrodatná odchylka ≤ 7,9 %, což indikuje dostatečnou přesnost a precizi pro forenzní použití.

Chromatogramy MRM pro jednotlivé sloučeniny byly optimalizovány pro selektivní kvantifikaci, přičemž interní standard zajišťoval korekci přípravných výkyvů. Použití Micro Volume QuEChERS zajistilo jednoduchou a rychlou extrakci z malého objemu krve.

Přínosy a praktické využití metody

Hlavní praktické přínosy:

• Komplexnost: jednorázové kvantitativní stanovení 27 antidiabetik různých struktur v jedné analýze šetří čas a zdroje laboratoře.
• Citlivost a rozsah: detekce na úrovni ~0,1 ng/mL a široké dynamické rozmezí umožňují stanovení při intoxikacích i terapeutických koncentracích.
• Kompatibilita: metoda je slučitelná s pracovním postupem LC/MS/MS Forensic Toxicology Database, což usnadňuje integraci do existujících toxikologických panelů a paralelní analýzu dalších látek.
• Efektivita přípravy: Micro Volume QuEChERS poskytuje rychlý, malovolumní protokol vhodný pro rutinní i forenzní aplikace.

Budoucí trendy a možnosti využití

Možnosti dalšího rozvoje a uplatnění zahrnují:

• Rozšíření panelu o metabolity a nové/fenotypické deriváty antidiabetik, které se mohou vyskytnout při nelegálním užívání nebo při aplikaci moderních léčiv.
• Integrace vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrie (HRMS) pro nečekané nebo neznámé látky a pro screening bez předdefinovaných MRM přechodů.
• Automatizace a robotizace předúpravy (QuEChERS) pro zvýšení průchodnosti a konzistence v rutinních laboratořích.
• Validace metody podle akreditačních standardů (např. ISO/IEC 17025) pro nasazení v soudní praxi a klinické toxikologii.
• Využití metody v epidemiologických studiích sledování zneužívání antidiabetik a v klinickém monitorování adherence nebo intoxikací.

Závěr

Prezentovaná LC–MS/MS metoda na platformě Nexera X3 + LCMS-8050RX společně s Micro Volume QuEChERS umožňuje spolehlivou, citlivou a rychlou kvantifikaci 27 antidiabetik v malém objemu plné krve. Díky vysoké citlivosti (detekce kolem 0,1 ng/mL), dobré linearitě a reprodukovatelnosti je metoda vhodná pro forenzní a výzkumné aplikace zaměřené na případy intoxikací, monitorování polyfarmacie nebo sledování nelegálního užívání.

Reference

1. Wasim Rauf Kadri, Khalid Raza, Comparison of Different Antidiabetic Medication Classes: Efficacy and Safety, European Journal of Cardiovascular Medicine, Vol. 15, 10. Oct. 2025, p. 223-227.