Fit-for-Purpose Rapid Gradient HILIC-MS Analysis for N-Glycan Profiling

Význam tématu

Rychlá, reprodukovatelná a kvantitativní analýza N‑glykosylace Fc části terapeutických protilátek je klíčová pro řízení kvality (CQA), kontrolu výrobního procesu a zajištění biologické účinnosti. Tradiční HILIC separace uvolněných a značených N‑glykanů často trvá desítky minut, což omezuje propustnost při screeningových studiích, optimalizaci procesů a near‑real‑time monitoringu. Popisovaná 10minutová HILIC‑MS metoda představuje kompromis mezi rychlostí a analytickou informací, který umožňuje zvýšit průchodnost laboratoře bez ztráty významných kvantitativních ukazatelů glykanové profily.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a ověřit zkrácenou 10minutovou HILIC metodu pro analýzu uvolněných N‑glykanů, která poskytne kvantitativně ekvivalentní výsledky oproti standardní 55minutové metodě. Studie hodnotila schopnost metody zachytit klíčové glykanové atributy (galaktosylace, core fukosylace, vysokomannózní obsah) a aplikovala ji na CHO kultury s modifikací glykozylace pomocí 2‑F‑peracetyl‑fucozy (2‑FP) a doplňování galaktózy, aby se ověřila citlivost metody na biologicky relevantní změny.

Použitá metodika

Popis vzorkování a zpracování:

• Výchozí materiál: NISTCHO buněčná linie exprimující NISTmAb IgG1, fed‑batch kultury s řízeným doplňováním glukózy a modifikačními přísadami (2‑FP, galaktóza) vs. kontrola.
• Purifikace: automatizovaná Protein A afinitní purifikace na Andrew+ automatizovaném robotickém pracovišti; eluováno 0.1 % kyselinou mravenčí.
• Uvolnění a značení glykanů: PNGase F uvolnění následované značením RapiFluor‑MS, postup proveden plně automatizovaně na Andrew+ s krátkými inkubačními kroky (celkově minuty místo hodin) a čistěním na µElution SPE destičkách podle GlycoWorks postupu.
• Chromatografie a detekce: HILIC separace s dvěma gradienty (konvenční 55 min na 150 mm kolonce a zrychlená 10 min na 50 mm kolonce) s vysokorychlostním UPLC; detekce pomocí vysokorozlišovacího hmotnostního spektrometru (MS) a extrahovaných iontových chromatogramů (XIC) pro selektivní kvantifikaci.

Metodická poznámka: zkrácený gradient snižuje chromatografické rozlišení izomerů, proto je pro identifikaci a kvantifikaci jednotlivých struktur nutná masově‑špecifická detekce a sumarizace izomerů do kategorií (např. součet G1F isomerů) odpovídající běžným reportovacím praxím.

Použitá instrumentace

• BioAccord Premier BSM vysokorozlišovací MS (Waters)
• ACQUITY Premier UPLC systém (Waters)
• Andrew+ Liquid Handling Robot pro automatizovanou purifikaci a derivatizaci
• GlycoWorks RapiFluor‑MS N‑Glycan Kit (zahrnuje RapiFluor‑MS reagenst a protokoly)
• Protein A affinity resin (analytická škála), µElution SPE destičky
• BioProfile FLEX2 analyzátor pro monitorování metabolitů během kultivace
• HILIC kolony v délce 150 mm (55 min gradient) a 50 mm (10 min gradient)

Hlavní výsledky a diskuse

• Čas analýzy: 10minutová metoda zkrátila dobu běhu o ~80 % oproti 55minutové, čímž výrazně zvýšila propustnost při zachování operativní robustnosti.
• Kvantitativní srovnání: relativní zastoupení hlavních Fc glykanů (G0F, součet G1F isomerů, G2F, vysokomannózní formy) bylo mezi oběma metodami vysoce konzistentní; rozdíly spadaly do typické analytické variability.
• Izomerická rozlišení: 10minutová metoda vykazovala částečnou koeluci u polozičních izomerů (např. G1F isomerů), avšak běžné reportování sumárních tříd (G1F celkem) zůstává nesporné a klinicky relevantní.
• Citlivost na biologické změny: při suplementaci 2‑FP došlo k potlačení core fukosylace a nárůstu afukosylovaných forem; galaktóza vedla k posunu od G0/G0F k G1/G1F a G2/G2F. Obě změny byly stejně dobře zachyceny 10min metodou i 55min metodou.
• Kvantitativní souhrnné ukazatele: celkové %fukosylace a %galaktosylace byly mezi metodami shodné, což podporuje použití zkrácené metody pro rozhodovací a kontrolní účely.
• Limitace: nižší rozlišení izomerů a vyšší %RSD u stopových a velmi nízkoabundantních species blízko LOQ; doporučuje se MS‑specifická detekce a případná další analýza dlouhým gradientem pro strukturální charakterizaci.

Přínosy a praktické využití metody

• Podstatné zvýšení throughput pro screening klonů, optimalizaci kultivačních podmínek a near‑real‑time dohled nad glykanovými CQA v bioprocesech.
• Kompatibilita s automatizovaným workflow (Protein A purifikace, automatizované uvolnění a značení) vhodná pro vysokoprostorové laboratoře.
• Umožňuje spolehlivé kvantitativní hlášení klíčových farmaceuticky relevantních atributů (galaktosylace, fukosylace, vysokomannózní podíl) v souladu s regulačními očekáváními orientovanými na sumarizované glykanové třídy.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s plně automatizovanými vstupními liniemi a informatikou pro near‑real‑time rozhodování v běhu výroby (process analytical technology, PAT).
• Další zkracování doby přípravy vzorku a vývoj rychlých, citlivých derivatizačních chemikálií pro zvýšení signálu u stopových species.
• Hybridní pracovní postupy: rychlé screeny 10min metodou pro procesní rozhodnutí následované cílenou dlouhou separací pro strukturální charakterizaci nových nebo neočekávaných forem.
• Rozšíření aplikace i na jiné glykoproteiny a biosimilární studie, kde vysoká propustnost je kritická.

Závěr

Zkrácená 10minutová HILIC‑MS metoda nabízí výhodný kompromis mezi rychlostí a analytickou kvalitou: zachovává kvantitativní věrnost pro hlavní a klinicky relevantní glykanové atributy a současně výrazně zvyšuje analytickou propustnost. Omezené izomerické rozlišení neovlivňuje běžné reportování ani regulačně významné souhrnné ukazatele. Metoda je vhodná jako fit‑for‑purpose nástroj pro vysokopropustné procesní studie, kontrolu kvality a podporu rozhodování v moderních biomanufacturing prostředích.

Reference

1. Crescioli S.; et al. Antibodies to Watch in 2024. mAbs 2024, 16(1), 2297450.
2. Ecker D. M.; Jones S. D.; Levine H. L. The Therapeutic Monoclonal Antibody Market. mAbs 2015, 7(1), 9–14.
3. Reusch D.; Tejada M. Fc Glycans of Therapeutic Antibodies as Critical Quality Attributes. Glycobiology 2015, 25, 1325–1334.
4. Mimura Y.; et al. Glycosylation Engineering of Therapeutic IgG Antibodies: Challenges for the Safety, Functionality and Efficacy. Protein Cell 2018, 9, 47–62.
5. Shinkawa T.; et al. The absence of fucose but not the presence of galactose or bisecting N‑acetylglucosamine of human IgG1 complex‑type oligosaccharides shows the critical role of enhancing antibody‑dependent cellular cytotoxicity. J. Biol. Chem. 2003, 278, 3466–3473.
6. Shields R. L.; et al. Lack of fucose on human IgG1 N‑linked oligosaccharide improves binding to human Fc gamma RIII and antibody‑dependent cellular toxicity. J. Biol. Chem. 2002, 277, 26733–26740.
7. Goetze A. M.; et al. High‑mannose glycans on the Fc region of therapeutic IgG antibodies increase serum clearance in humans. Glycobiology 2011, 21(7), 949–959.
8. Houel S.; et al. N‑ and O‑Glycosylation Analysis of Etanercept Using LC‑QTOF MS with ETD. Anal. Chem. 2014, 86, 576–584.
9. Lauber M. A.; et al. Rapid Preparation of Released N‑Glycans for HILIC Analysis Using a Labeling Reagent that Facilitates Sensitive Fluorescence and ESI‑MS Detection. Anal. Chem. 2015, 87(10), 5401–5409.
10. Segu Z.; et al. A rapid method for relative quantification of N‑glycans from a therapeutic monoclonal antibody during trastuzumab biosimilar development. mAbs 2020, 12(1), 1750794.
11. Dahodwala H.; et al. Development and Characterization of the NISTCHO Reference Cell Line. Biotechnol. J. 2025, 20(5), e70012.
12. Alelyunas Y. W.; Wushensky J.; Wrona M.; Chen R. Analytical Scale 96‑well Protein A Affinity Resin‑Based Purification using Andrew+ Automation Robot Supporting Upstream Bioprocessing. Waters Application Note 2025.
13. GlycoWorks RapiFluor‑MS N‑Glycan Care and Use Manual. Waters, 2024.
14. ICH Q6B: Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products. 1999 (adopted by FDA).
15. Becker D. J.; Lowe J. B. Fucose: Biosynthesis and Biological Function in Mammals. Glycobiology 2003, 13(7), 41R–53R.
16. Wells E. J.; et al. Media Supplementation with 2‑F‑Peracetyl‑Fucose and Galactose Differentially Modulates Antibody Glycosylation in CHO Cells. Biotechnol. Bioeng. 2020, 117(11), 3310–3321.
17. Ehret J.; et al. Impact of Cell Culture Media Additives on IgG Glycosylation Produced in Chinese Hamster Ovary Cells. Biotechnol. Bioeng. 2018, 115(4), 1039–1051.
18. Sumit M.; et al. Dissecting N‑Glycosylation Dynamics in Chinese Hamster Ovary Cells Fed‑Batch Cultures Using Time‑Course Omics Analyses. iScience 2019, 19, 782–795.