An ultrafast, batch-to-batch comparison of monoclonal antibody glycosylation

Význam tématu

Glykozylace monoklonálních protilátek představuje klíčový kritický kvalitativní atribut ovlivňující stabilitu, farmakokinetiku, imunitní odpověď a účinnost bioterapeutik. Rychlé a reprodukovatelné hodnocení rozložení glykoforem napříč výrobními šaržemi je nezbytné pro zajištění kvality, souladu s regulačními požadavky a implementaci principů Quality by Design v bioprodukci.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout vysokopropustnou (HTP) metodu založenou na HILIC UHPLC separaci 2-AA značených N-glykánů z modelové monoklonální protilátky (rituximabu) jako koncept pro obecný přístup k glykoprofilování mAb. Metoda měla poskytnout rychlou separaci (< 3 min) s dostatečným rozlišením k identifikaci rozdílů ve vysoce zastoupených glykofor­mách a potvrzení struktur pomocí vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrie.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika zahrnovala denaturaci, redukci a alkylaci protilátky, uvolnění N-glykánů enzymem PNGase F, následné sušení a redukci aldosových foriem, značení 2-aminobenzoovou kyselinou (2-AA) a HILIC purifikaci.

• Chromatografie: Vanquish Horizon UHPLC s Accucore 150-Amide-HILIC kolonkou (2.1 × 50 mm, 2.6 µm); lineární gradient A: 50 mM amonný formiát pH 4.5 / B: acetonitril; průtok 2.2 mL/min, 60 °C, objem injekce 5 µL, doba 2.5 min.
• Detekce: Fluorescenční detektor (λex/em 350/425 nm).
• MS: Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap MS se HESI ionizací, rozsah m/z 500–2000, režim negativní ionizace.
• Systém pro čistění a přípravu vzorků: Thermo Scientific UltiMate 3000 RS, 10 kDa MWCO filtry, SpeedVac.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila separaci osmi dominantních 2-AA značených biantennárních glykoforem (včetně základní vysokomannózní formy) do 2.5 min, což představuje ~20× zkrácení oproti standardním 55min profilům. Retenční časy vykázaly velmi vysokou přesnost při sedmi po sobě jdoucích injekcích (± několik ms). Batch-to-batch porovnání rituximabu odhalilo rozdíly ve relativním zastoupení glykoforem č. 6, 7 a 8 mezi čerstvou šarží a dvěma surplusovými vzorky.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlý screening glykoforem s vysokou propustností pro QA/QC.
• Unambiguous identifikace hlavních glykoforem a jejich porovnání mezi šaržemi.
• Zkrácení doby analýzy znamená vyšší efektivitu laboratoří a nižší náklady.
• Podpora vývoje nových mAb a biosimilárních výrobků v kontextu QbD.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace do automatizovaných procesů a on-line monitorování glykozylace.
• Rozšíření metodiky na další glykoproteiny a komplexnější glykomy.
• Využití strojového učení a AI pro pokročilé zpracování dat a predikci kvalitativních parametrů.
• Regulatorní uznání HTP glykoprofily jako standardní QC techniky v biopharmaceutickém průmyslu.

Závěr

Vyvinutá HILIC UHPLC-FLD workflow s MS potvrzením poskytuje ultrarychlou, přesnou a reprodukovatelnou glykoprofilaci mAb během 2.5 min. Metoda je vhodná pro robustní batch-to-batch porovnání, podporuje vývoj i kontrolu kvality biotherapeutik a usnadňuje implementaci QbD přístupů.

Reference

1. Dumont J., Euwart D., Mei B. a kol. Human cell lines for biopharmaceutical manufacturing: history, status and future perspectives. Critical Reviews in Biotechnology, 2016, 26(6), 1110–1122.
2. Ghaderi D., Zhang M., Hurtado-Ziola N., Varki A. Production platforms for biotherapeutic glycoproteins: occurrence, impact, and challenges on non-human sialylation. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, 2012, 28, 147–176.
3. Shinkawa T., Nakamura K., Yamane N., Shoji-Hosaka E. a kol. The absence of fucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetylglucosamine of human IgG1 complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity. Journal of Biological Chemistry, 2003, 278, 3466–3473.
4. Reusch D., Tejada M.L. Fc glycans of therapeutic antibodies as critical quality attributes. Glycobiology, 2015, 25(12), 1325–1334.
5. Yu M., Brown D., Reed C., Chung S. a kol. Production, characterization and pharmacokinetic properties of antibodies with N-linked Mannose-5 glycans. mAbs, 2012, 4(4), 475–487.
6. Xu X., Nagarajan H., Lewis N.E. a kol. The genomic sequence of the Chinese hamster ovary (CHO)-K1 cell line. Nature Biotechnology, 2011, 29(8), 735–742.
7. Ivarsson M., Villiger T.K., Morbidelli M., Soos M. Evaluating the impact of cell culture process parameters on monoclonal antibody N-glycosylation. Journal of Biotechnology, 2014, 188, 88–96.
8. Well E.A., Robinson A.S. Cellular engineering for therapeutic protein production: product quality, host modification, and process improvement. Biotechnology Journal, 2017, 12, 1600105.
9. Fernandes D. Demonstrating comparability of antibody glycosylation during biomanufacturing. European Biopharmaceutical Review, 2005, 106–110.
10. Millán S., Mittermayr S., Farrell A., Bones J. Fast profiling of the N-glycan population in biotherapeutic antibodies by UHPLC-FLD with MS confirmation. Thermo Fisher Scientific Application Note AN21652, 2017.