Simultaneous quantitation and discovery (SQUAD) analysis of the fruit juice metabolome

Význam tématu

Analýza metabolomu ovocných šťáv poskytuje důležité informace o nutriční hodnotě, zdravotních účincích a vlivu technologického zpracování na kvalitu potravin. Zvláštní pozornost si zaslouží flavonoidy — polyfenolické sloučeniny často vázané jako glykozidy — které ovlivňují antioxidační vlastnosti a konzervaci chuti. Schopnost současně kvantifikovat cílené polyfenoly a objevovat nové přírodní produkty v jednom LC‑MS běhu významně zvyšuje produktivitu a rozšiřuje škálu aplikací v potravinářské a přírodní produktové chemii.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo předvést integrovaný SQUAD (Simultaneous Quantitation and Discovery) pracovní postup pro komplexní profilování komerčních ovocných šťáv. Práce demonstruje, jak v jediném analytickém běhu získat přesnou kvantifikaci známých polyfenolů současně s untargeted objevováním a strukturálním objasněním neznámých flavonoidů pomocí Orbitrap Ascend MultiOmics Tribrid MS a softwaru Compound Discoverer.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky a příprava:

• Analýza pěti komerčních vzorků: brusinka, vinná réva, třešeň, limonáda a melounová limonáda.
• Vzorky byly před analýzou filtrovány a zředěny 1:1 (v/v) methanolem; kalibrační standardy polyfenolů (rutin, kvercetin, kyselina rozmarínová) připraveny ve vodě:methanol 1:1.
• Kalibrační rozsah pro kvantifikaci: 10–1 000 ppb.

Chromatografie:

• UHPLC: Thermo Scientific Vanquish Flex s Accucore aQ kolonkou 100 × 2.1 mm, 2.6 µm.
• Mobilní fáze: A = 0,1 % kyselina mravenčí ve vodě; B = 0,1 % kyselina mravenčí v methanolu.
• Gradient uveden v aplikaci (počátečně 97 % A → 5 % A), průtok 0,4 mL/min, teplota kolony 35 °C, injekční objem 2 µL.

Hmotnostní spektrometrie a akvizice:

• Orbitrap Ascend MultiOmics Tribrid MS s OptaMax NG H‑ESI zdrojem; EASY‑IC interní kalibrace.
• Režim polarity: střídavě pozitivní a negativní během jednoho běhu; full‑scan m/z 150–1 200.
• Rozlišení: full‑scan 120 000 (FWHM @ m/z 200); MS¹ v ddMSⁿ 60 000; MS²/MS³ 30 000.
• Rozhodovací strom pro akvizici (SQUAD/ddMSⁿ): pro prekurzory <420 Da → HCD MS²; pro >420 Da → CID MS² a při detekci charakteristických neutrál. ztrát (cukry) se spouští až 2x CID MS³.
• Cycle time 0.9 s; prahová intenzita MS² 50 000; dynamické vyloučení 3 s; maximální injekční časy: MS² 100 ms, MS³ 200 ms.
• Kolidní energie: MS²‑CID 35 %; MS²‑HCD normalizované třístupňové 20/40/70 %.
• AcquireX Deep Scan inteligentní workflow použité pro rozšířené fragmentační pokrytí.

Softwarové zpracování:

• TraceFinder 5.2 pro cílenou kvantifikaci.
• Compound Discoverer 3.5 s upraveným Natural Product Unknown ID with Stats workflow pro untargeted identifikaci, FISh scoring, Molecular Networks, Search Neutral Losses a diferencální analýzu (PCA, cluster, volcano plot).

Použitá instrumentace

Seznam hlavního vybavení použitého ve studii:

• Thermo Scientific Vanquish Flex UHPLC System.
• Accucore aQ kolona 100 × 2.1 mm, 2.6 µm.
• Thermo Scientific Orbitrap Ascend MultiOmics Tribrid Mass Spectrometer s OptaMax NG H‑ESI zdrojem a EASY‑IC interní kalibrací.
• Softwarové nástroje: Xcalibur 4.7 (akvizice), TraceFinder 5.2 (kvantifikace), Compound Discoverer 3.5 (untargeted analýza), AcquireX Deep Scan workflow.

Hlavní výsledky a diskuse

Integrovaný SQUAD pracovní postup umožnil úspěšné současné provedení přesné kvantifikace a rozsáhlého untargeted profilování v jediném běhu. Klíčové poznatky:

• Kalibrační křivky pro rosmarinovou kyselinu (negativní mód) a rutin (pozitivní mód) vykázaly linearitu v rozsahu 10–1 000 ppb, což potvrzuje vhodnost metody pro kvantitativní analýzu polyfenolů v potravinových matricích.
• Rozhodovací strom ddMSⁿ výrazně zvýšil množství získaných strukturových informací tím, že u těžších prekurzorů (>420 Da) spouštěl MS³ při detekci charakteristických ztrát sacharidů, což umožnilo detailní elucidaci flavonoidních glykozidů (příklady: rutin m/z 611.1609, katechin m/z 291.086).
• Compound Discoverer s FISh scoringem a srovnáním s mzCloud/mzVault knihovnami umožnil putativní identifikace řady flavonoidů (např. kaempferol 3‑robinobioside, rhamnetin 3‑galactoside); u neznámých sloučenin bylo možné upřednostnit strukturální návrhy (např. myricetin 5‑O‑glucuronide vs. gossypetin 3‑glucuronide) na základě pokrytí fragmentů.
• Molekulární sítě agregovaly příbuzné flavonoidní funkční skupiny a transformace (např. glukuronidace, redukce nitro skupiny), což usnadnilo objevování potenciálně nových naturalních produktů.
• Diferenciální analýzy (PCA, hierarchické shlukování, volcano plot) identifikovaly metabolity diskriminující mezi typy šťáv (např. tart cherry vs. grape) a poskytly přehled o rozdílech v profilu polyfenolů.

Přínosy a praktické využití metody

Hlavní výhody a oblasti nasazení pracovního postupu:

• Zvýšená produktivita díky možnosti kombinovat cílenou kvantifikaci a untargeted objevování v jediném LC‑MS běhu.
• Vyšší jistota identifikace díky vysokému rozlišení, přesné hmotnosti a multi‑stupňové fragmentaci (MSⁿ).
• Užitečné pro potravinářské kontroly kvality, ověřování autentičnosti, hodnocení vlivu zpracování, legislativní kontroly a výzkum přírodních produktů.
• Workflow je flexibilní a přenositelný na analýzu jiných tříd sloučenin v komplexních matricích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Potenciální směřování rozvoje a rozšíření metody:

• Rozšíření analyzovaných tříd látek a integrace více datových vrstev (multiomics) pro komplexnější biologický kontext.
• Využití pokročilých fragmentačních technik dostupných na platformě (UVPD, ETD, PTCR) pro lepší lokalizaci modifikací a mapování vazebných míst.
• Automatizace anotací pomocí strojového učení a větších referenčních databází pro rychlejší a spolehlivější identifikace nových naturalních produktů.
• Optimalizace throughputu a robustnosti pro rutinní QA/QC aplikace v průmyslových laboratořích.

Závěr

Popsaný SQUAD pracovní postup na bázi Orbitrap Ascend MultiOmics Tribrid MS a Compound Discoverer umožňuje efektivní kombinaci cílené kvantifikace a hloubkového untargeted objevování v jediné analýze ovocných šťáv. Vysoké rozlišení, inteligentní ddMSⁿ akvizice a pokročilá softwarová analýza poskytují bohaté strukturální informace, které usnadňují identifikaci flavonoidů, lokalizaci modifikací glykozidů a objevení nových naturalních produktů. Metodu lze široce aplikovat v potravinářství, přírodních produktech a výzkumu metabolomiky.

Reference

1. Thermo Fisher Scientific Application Note 003277: Novel structure-based profiling and annotation workflow-high-throughput analysis of flavonoids using the Thermo Scientific Orbitrap ID-X Tribrid MS.
2. Thermo Fisher Scientific Technical Note 004327: Simultaneous Quantitation and Discovery analysis: Combining targeted and untargeted metabolomics on Orbitrap mass spectrometers.
3. Thermo Fisher Scientific Application Note 003385: Confident transformation site localization of PROTAC drug metabolites facilitated by multi-stage fragmentation LC-MS.
4. Thermo Fisher Scientific Application Note 002154: Increased confidence in drug metabolite identification through intelligent data acquisition strategies and multiple fragmentation techniques on the Orbitrap Tribrid MS platform.
5. Thermo Fisher Scientific Product Specification 002859: Scale up your multiomics research Orbitrap Ascend MultiOmics Tribrid mass spectrometer.