Liraglutide Native SEC-MALS Characterization Using Empower™ Chromatography Data System (CDS)

Význam tématu

Liraglutide je biologicky aktivní peptid užívaný v léčbě metabolických onemocnění, jeho fyzikálně-chemická stabilita a oligomerizační stav přímo ovlivňují bezpečnost a účinnost přípravku. Charakterizace ve „native" (ne-denaturačních) podmínkách je proto nezbytná pro pochopení skutečného složení formulace, přítomnosti vyšších uskupení a agregátů a pro validaci výrobních a skladovacích procesů. SEC spojená s MALS a dRI poskytuje kalibračně nezávislé stanovení absolutní molární hmotnosti a kvantifikaci masových podílů, což je kritické pro přesné hodnocení agregace u nízkomolekulárních peptidů jako liraglutide.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo demonstrovat použití native SEC-MALS pro přesné určení molární hmotnosti a kvantifikaci oligomerů liraglutidu v podmínkách relevantních pro finální formulaci. Studie ukazuje integrovaný workflow řízený softwarem Empower CDS 3.10.0 pro akvizici dat, zpracování signálů MALS a dRI a automatizované reportování bez nutnosti kalibrace SEC standardy.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda: SEC v ne-denaturačních pufrech s multi-angle light scattering pro absolutní molární hmotnosti a dRI pro koncentraci.
Klíčové parametry:

• HPLC systém: Arc Premier se čtyřkanálovým ředěním a správcem vzorků.
• Kolona: XBridge Premier Protein SEC, 250 Å póry, 2.5 µm, 7.8 × 300 mm (pro separaci vyšších oligomerů).
• Mobilní fáze: 10 mM Na2HPO4, pH 8.1.
• Průtok: 0.5 mL/min.
• Detektory: DAWN MALS fotometrie (víceúhlové rozptylové měření), Optilab dRI pro diferenciální index lomu; pro srovnání byla k dispozici i PDA (Arc Premier 2998), ale primární kvantifikace proběhla dRI.
• Software: Empower 3.10.0 CDS s rozšířením pro MALS analýzu, použit tradiční integrační algoritmus pro automatickou detekci špiček.
• Konstanty a vstupy: dn/dc = 0.185 mL/g (použito pro všechna měření), molární absorpční koeficient liraglutidu při 280 nm = 6990 M⁻¹ cm⁻¹ (1.86 (mg/mL)⁻¹ cm⁻¹).

Praktické odůvodnění výběru: větší pórovitost kolony zabránila vylučovacím artefaktům při separaci větších oligomerů; dRI byl upřednostněn před UV, protože částicové uskupení ~20–30 nm mohou způsobit rozptyl světla a tím zkreslit UV kvantifikaci.

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza byla provedena na liraglutide drug substance 6 mg/mL — koncentraci reprezentativní pro finální formulaci. Chromatogram vykázal dvě hlavní špičky: primární špička (cca 13 min) a sekundární špička odpovídající vyšším oligomerům.

• MALS-dRI výsledky: primární složka tvořila 90.7 % celkové hmoty (CV 0.4 %) a hodnotou Mw = 22.4 kDa (CV 0.7 %, triplikáty). Tato molární hmotnost je v souladu s hexamerem vzhledem k teor. monomerní hmotnosti ~3.75 kDa.
• Sekundární špička vykázala Mw ≈ 50 kDa, konzistentní s ~13-merovou formou.
• Monomer byl v těchto nativních podmínkách detekován nebyl, což koresponduje s dřívějšími publikacemi.

Diskuse: kombinace SEC s MALS+dRI eliminovala potřebu elucí založených na kalibraci a přinesla absolutní určení molární hmotnosti i u smíšených populací oligomerů. Volba dRI snížila chybu způsobenou rozptylem u větších částic, která by mohla vést k nadhodnocení agregátů při UV-kvantifikaci. Empower CDS umožnil reprodukovatelné automatické integrační zpracování bez pevného časového okna, což zjednodušuje nasazení metody v rutině.

Přínosy a praktické využití metody

Hlavní přínosy řešení SEC-MALS/dRI v nativních podmínkách:

• Kalkulačně nezávislé (absolutní) stanovení molární hmotnosti bez standardů.
• Přesná kvantifikace masových podílů oligomerů a agregátů ve formulaci.
• Možnost pracovat v bufferových podmínkách relevantních pro finální produkt včetně solí, které jsou pro MS často nevhodné.
• Vyšší spolehlivost oproti UV detekci při přítomnosti částic větších než ~20 nm.
• Integrovaný a automatizovatelný workflow v Empower CDS vhodný pro QA/QC i vývojové laboratorní prostředí.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje a aplikace:

• Rozšíření native SEC-MALS na další GLP-1 analoga a lipidované peptidy k systematickému mapování oligomerizačních stavů napříč formulacemi.
• Integrace s orthogonálními technikami (např. denaturační SEC-MALS, analytická ultracentrifugace, cryo-EM) pro potvrzení struktury a stability agregátů.
• Zlepšení automatizace datového workflow a pokročilá modelová analýza pro heterogenní populace částic.
• Vývoj kolon a materiálů optimalizovaných pro velmi široké rozmezí velikostí (od monomerů až po velké oligomery/fibrily).

Závěr

Studie demonstruje, že native SEC-MALS s dRI poskytuje robustní a přesný přístup pro určování absolutní molární hmotnosti a kvantifikaci oligomerů liraglutidu v podmínkách relevantních pro finální formulaci. Volba 250 Å SEC kolony, použití dn/dc = 0.185 mL/g a aplikace dRI kvantifikace minimalizují chyby spojené s vylučovacími efekty a optickým rozptylem, zatímco Empower CDS zjednodušuje a standardizuje zpracování dat. Metoda je vhodná pro rutinní kontrolu kvality i výzkumné účely při hodnocení stability a agregace peptidických léčiv.

Reference

1. Brichtová E, Přáda E, et al. Glucagon-like peptide 1 aggregates into low-molecular-weight oligomers off-pathway to fibrillation. Biophysical Journal. 2023;122(12):2475–2488.
2. Přáda Brichtová E, et al. Effect of Lipidation on the Structure, Oligomerization, and Aggregation of Glucagon-like Peptide 1. Bioconjugate Chemistry. 2025;36(3):401–414.
3. Zhang X, et al. Identification of GLP-1 analog oligomeric states using SEC-MALS. Application Note, Wyatt Technology Corporation. 2019.
4. Bothe JR, et al. Peptide oligomerization memory effects and their impact on the physical stability of the GLP-1 agonist liraglutide. Molecular Pharmaceutics. 2019;16(5):2153–2161.