Size Exclusion Chromatography- Based Identification of Liraglutide Oligomeric Forms

Význam tématu

Analýza oligomerických forem terapeutických peptidů je zásadní pro hodnocení jejich stability a biologické účinnosti. Liraglutid jako analog GLP1 s konjugovaným nasyceným acylovým řetězcem vytváří micelárně podobné struktury, jejichž charakterizace je klíčová pro vývoj a kontrolu kvality lékových forem.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo vyvinout a optimalizovat metodu na bázi velikostní exkluze chromatografie spojené s UV detekcí a Q-TOF hmotnostní spektrometrií pro identifikaci a kvantifikaci oligomerů liraglutidu při různém pH. Studie demonstruje workflow zahrnující biokompatibilní kolony a pokročilé LC/MS přístroje pro detailní pohled na oligomerizaci.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky liraglutidu byly připraveny v fosfátových pufrech pH 6.4 a 8.0 pro SEC/UV a v octanovém pufru pro SEC/MS. Pro SEC/UV byla použita kolona Agilent AdvanceBio SEC 130 Å 7.8×300 mm s mobilní fází 150 mM fosfát nebo směsí fosfát–acetonitril–arginin. Pro SEC/MS byla zvolena PEEK kolona 120 Å 2.1×150 mm s 20 mM octanem amonným. Instrumentace:

• Agilent 1290 Infinity II bio LC se čtyřmi čerpadly multisamplerem a multicolumn termostatem
• Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF s Dual Jet Stream ESI zdrojem
• Software OpenLab CDS verze 2.8 a MassHunter BioConfirm verze 12.1

Hlavní výsledky a diskuse

SEC/UV analyza ukázala, že při pH 6.4 převládají vyšší oligomery (cca 12-mer) a při pH 8.0 nižší oligomery (cca 3-mer). Kalibrace kolony potvrzuje vhodnost AdvanceBio SEC 130 Å pro separaci proteinových standardů. SEC/MS monitoring ukázal časově závislou tvorbu oligomerů od 2 až 6-mer v čerstvém vzorku po 12 až 15-mer po třech dnech inkubace. Výsledky podporují význam pH a hydrofobně-hydrofobních interakcí v procesu samosestavování.

Přínosy a praktické využití metody

Navržené řešení umožňuje rychlou a spolehlivou charakterizaci oligomerických stavů peptidů v rámci vývoje a kontroly kvality biotechnologických léčiv. Kombinace SEC/UV a SEC/MS přináší komplexní přístup k identifikaci a kvantifikaci komplexních peptidových agregátů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další výzkum může zaměřit na detailní studium interakcí monomerů při různých teplotách využití nových biokompatibilních materiálů pro kolony a mikročipových řešení pro in situ monitorování oligomerizace. Rozšíření na další lipidované peptidy a integrace s pokročilou datovou analýzou nabízí potenciál pro zrychlení vývoje peptidových léčiv.

Závěr

Metoda založená na SEC/UV a SEC/Q-TOF ukázala vysokou účinnost při rozlišení a charakterizaci oligomerických forem liraglutidu. Závislost oligomerizace na pH a času inkubace poskytuje důležité informace pro optimalizaci formulací a výroby GLP1 analogů.

Reference

1. Nadkarni P, Chepurny OG, Holz GG. Regulation of glucose homeostasis by GLP-1. Prog Mol Biol Transl Sci. 2014;121:23-65.
2. Dehsorkhi A, Castelletto V, Hamley IW. Self-assembling amphiphilic peptides. J Pept Sci. 2014;20(7):453-467.
3. Brichtova EP, Krupova M, Bour P, Lindo V, Gomes dos Santos A, Jackson SE. GLP-1 aggregates into low molecular weight oligomers off-pathway to fibrillation. Biophys J. 2023;122(12):2475-2488.
4. Bothe JR, Andrews A, Smith KJ, Joyce LA, Krishnamachari Y, Kashi S. Peptide oligomerization memory effects and their impact on the physical stability of liraglutide. Mol Pharm. 2019;16(5):2153-2161.
5. Wang Y, Lomakin A, Kanai S, Alex R, Benedek GB. Transformation of oligomers of lipidated peptide induced by change in pH. Mol Pharmaceutics. 2015;12(2):411-419.
6. Kuo ST, Xi Z, Cong X, Yan X, Russell DH. Unveiling the hidden: dissecting liraglutide oligomerization dual pathways via direct mass technology electron capture dissociation and molecular dynamics. bioRxiv. 2025.