Efficient Recovery and Analysis of Phosphopeptides using Improved Chromatographic Surface Chemistry and a New Multi-Reflecting-TOF Mass Spectrometer

Význam tématu

Phosphopeptidy jsou klíčové pro studium buněčné signalizace a post-translačních modifikací, avšak jejich analýza pomocí LC-MS je náročná kvůli silným interakcím fosfátových skupin s kovovými povrchy v kapalinové cestě. Tyto interakce vedou k adsorpci analytů, nízké návratnosti a špatnému tvaru chromatografických píků, což omezuje citlivost a spolehlivost fosfoproteomických workflow. Zlepšení povrchové chemie průtokového hardwaru a využití vysoce výkonného hmotnostního spektrometru je proto zásadní pro zvýšení citlivosti, přesnosti a reprodukovatelnosti měření v aplikacích s nízkým množstvím vzorku.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo porovnat nové High-Performance Surfaces (HPS; komerční označení MaxPeak Premier) navázané na 300 µm microflow kolonách se standardním nerezovým (stainless-steel) hardwarem v kontextu analýzy phosphopeptidů. Studie hodnotila návratnost phosphopeptidů, chromatografický tvar píků a výkon LC-MS z hlediska citlivosti a informativnosti MS/MS spektrogramů. Testovacími vzorky byly tryptické digesty enolázy a kaseinu, včetně standardních phosphopeptidních směsí.

Použitá metodika a instrumentace

• Chromatografické uspořádání: ACQUITY M-Class System v microflow režimu s low-flow ESI sondou.
• Kolony: Porovnání HPS-modifikovaného 300 µm (MaxPeak Premier prototype) vs. standardní nerezové 300 µm kolony.
• Hmotnostní spektrometr: Xevo MRT (multi-reflecting TOF) s rozlišovací schopností ~100 000, podporou MS/MS až 100 Hz a sub-ppm hmotnostní přesností.
• Mobilní fáze: A = 0,1 % kyselina mravenčí ve vodě; B = 0,1 % kyselina mravenčí v acetonitrilu.
• Gradient a průtok: 1–40 % B během 30 minut při průtoku 8,0 µL/min.
• Předkondicionování kolony: tři injekce 1,0 pmol MassPREP BSA digest před analýzou 1,0 pmol phosphopeptidního standardu.

Hlavní výsledky a diskuse

• HPS povrch (MaxPeak Premier) výrazně snížil interakce mezi fosfátovými skupinami a kovovým povrchem, což vedlo k vyšší návratnosti phosphopeptidů ve srovnání se standardním nerezovým hardwarem.
• Chromatogramy enolázových a kaseinových phosphopeptidů ukázaly ostřejší pík, menší tailing a vyšší signál při použití HPS kolony. Zvýšená návratnost se projevila i v počtu unikátních detekovaných phosphopeptidů napříč triplikáty.
• Ve srovnání s nerezovým hardwarem HPS přinesl bohatší a více informativní fragmentační spektra (elevated-energy), což zlepšilo sekvenační informaci a identifikaci míst fosforylace.
• Xevo MRT poskytl vysoké rozlišení (~100k) a rychlé MS/MS snímání (až 100 Hz) s sub-ppm přesností, což podpořilo citlivé rozlišení izobarických iontů a přesnou identifikaci fragmentů.
• Tabulková data (přehled sekvencí, monizotopických hmot a m/z) byla použita pro vyhodnocení detekovatelnosti jednotlivých phosphopeptidů; grafické prezentace ukázaly nárůst průměrné celkové odpovědi phosphopeptidů při použití HPS hardware.

Přínosy a praktické využití metody

• Eliminace nebo minimalizace nutnosti složitého pre-passivačního postupu s chelátory (např. EDTA, kyselina citronová) zjednodušuje workflow a šetří čas laboratorní přípravy.
• HPS povrch zvyšuje citlivost a reprodukovatelnost při analýze nízkoodměrných a nízkokoncentračních phosphopeptidních vzorků, což je výhodné pro fosfoproteomiku s omezeným množstvím materiálu.
• Kombinace HPS kolony s vysokorychlostním a vysokorozlišovacím Xevo MRT umožňuje spolehlivou identifikaci míst fosforylace i v komplexních směsích a při rychlých gradientových separacích pomocí microflow LC.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další vývoj povrchových chemikálií a hybridních bariér povede k ještě menšímu vázání polarních modifikací a širšímu uplatnění pro další labile PTM (např. sulface nebo glykozylace).
• Integrace HPS hardware s automatizovanými microflow platformami a vyšší propustností přinese možnosti pro vysoko-výkonovou fosfoproteomiku ve výzkumu i v průmyslovém prostředí (QA/QC, klinická analytika).
• Využití multi-reflektujících TOF hmotnostních analyzátorů pro kombinované kvantitativní a kvalitativní studie, včetně datově nezávislé akvizice (DIA) s vysokou rychlostí skenování.
• Možnosti aplikací na vzorky s nízkým vstupem (single-cell proteomics, bioptické materiály) díky zvýšené citlivosti a vyšší návratnosti phosphopeptidů.

Závěr

Použití HPS (MaxPeak Premier) na 300 µm microflow kolonech výrazně zlepšuje návratnost a chromatografický výkon při analýze phosphopeptidů bez nutnosti časově náročného pre-passivačního ošetření. Ve spojení s vysokorozlišovacím Xevo MRT MS systémem studie prokázala zvýšenou citlivost, lepší pík-tvar a bohatší fragmentační informace, což podporuje použití tohoto přístupu v cílené i nekontrolované fosfoproteomice.

Použitá instrumentace

• ACQUITY M-Class System (microflow LC)
• Low-flow ESI probe
• MaxPeak Premier HPS 300 µm prototype columns (hybridní/inorgano-organická povrchová bariéra, kovalentně navázaná)
• Xevo MRT Mass Spectrometer (multi-reflecting TOF; ~100k rozlišení, MS/MS až 100 Hz, sub-ppm přesnost)
• Mobilní fáze: 0,1 % formiová kyselina ve vodě (A) a 0,1 % formiová kyselina v acetonitrilu (B); gradient 1–40 % B/30 min; průtok 8,0 µL/min

Reference

1. Liu S, et al. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2005;19(19):2747–2756.
2. Birdsall RE, et al. Journal of Chromatography B. 2019;1126–1127:121773.
3. DeLano M, et al. Analytical Chemistry. 2021;93:5773–5781.