Enhanced Recovery and Peak Shape of Acidic and Phosphopeptides Using Waters BioResolve™ Premier 1 mm ID Columns

Význam tématu

Kapilární a mikroflow chromatografie nabízejí vyšší citlivost a nižší spotřebu rozpouštědel, což je žádoucí v moderní high‑throughput proteomice. Nicméně kyselé peptidy a fosfopeptidy často trpí ztrátami a širokými, asymetrickými píky způsobenými nespecifickou adsorpcí na nerezové části chromatografického systému. Zlepšení povrchových vlastností hardware tak přímo zvyšuje kvalitu dat, citlivost identifikace a reprodukovatelnost výsledků v proteomických analýzách.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo porovnat obnovu a tvar píků kyselých peptidů v kapilárním a mikroflow režimu mezi kolonami Waters BioResolve Peptide C18 RP vybavenými MaxPeak Premier (HPS) technologií a ekvivalentními kolonami s nerezovým hardwarem od jiných výrobců. Studie hodnotila výkon na 1 mm a 300 µm ID kolónách, vliv kondicionace, vliv na kvalitu MS spekter a kompatibilitu s různými UHPLC systémy.

Použitá instrumentace

Hlavní prvky analytické sestavy a podmínky:

• Vzorek: MassPREP Enolase Digest s přidaným mixem fosfopeptidů.
• Kapalinová chromatografie: ACQUITY UPLC M‑Class System a ACQUITY Premier System.
• Kolony: BioResolve Peptide C18 RP BEH, MaxPeak Premier Technology, 1.7 µm, 300 Å (1.0×50 mm, 1.0×100 mm, 0.3×50 mm) a také 300 µm ID verze.
• Teploty: kolona 60 °C, vzorek 6 °C.
• Mobile fáze: 0.1 % kyselina mravenčí ve vodě (A) a 0.1 % kyselina mravenčí v acetonitrilu (B).
• Hmotnostní spektrometrie: Xevo G3 QToF s nízkoproudovou ESI sondou, režim ESI pozitivní, rozsah 50–2000 m/z.
• MS parametry: kapilární napětí 2.5 kV, teplota zdroje 120 °C, desolvace 250 °C, tok desolv. plynu 350 L/h, cone gas 50 L/h.

Použitá metodika

Autoři porovnávali chromatogramy a extrahované iontové chromatogramy (XIC) vybraných kyselých a referenčních peptidů mezi BioResolve MaxPeak Premier kolónami a konkurenčními reversed‑phase kolónami. Hodnotily se: počáteční obnova a tvar píků (včetně USP tailing faktoru), závislost plochy píku na čísle injekce (kondicionace), kapacita píků a kvalita MS spekter (hlasitost základny, přítomnost „column bleed“). Data byla snímána pro injekce 1., 3. a 5. a pro různé ID a chromatografické systémy, aby se posoudila přenositelnost výsledků.

Hlavní výsledky a diskuse

Klíčová zjištění studie:

• BioResolve kolony s MaxPeak Premier (HPS) vykazují vyšší obnovu a lepší tvar píků pro kyselé peptidy a fosfopeptidy již na první injekci, zatímco ekvivalentní nerezové kolony často vykazují nízkou obnovu a výrazné tailing na začátku.
• Kondicionace nerezových kolón zlepšuje jejich výkon, ale vyžaduje několik injekcí, zatímco MaxPeak Premier minimalizuje potřebu předběžného kondicionování.
• Výhody HPS byly pozorovány jak pro 1.0 mm ID kolony, tak pro 300 µm ID kolony, což potvrzuje použitelnost technologie v mikroflow i analytických přístrojích.
• Při porovnání se třemi konkurenčními kolónami měla BioResolve nejčistší MS spektra: signál triply nabitého iontu peptidu T35 byl o více než 40 % vyšší než na některých alternativách, u konkurenčních kolón byly zaznamenány vyšší úrovně šumu a artefakty způsobené column bleed nebo ko‑elucí více složek.
• Na ACQUITY Premier (analytický systém) se snížila kapacita píků v porovnání s M‑Class z důvodu většího post‑column dispersonu, avšak výsledky byly porovnatelné s 2.1×50 mm Premier kolónami při použití stejného systému.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické dopady implementace MaxPeak Premier (HPS) kolón:

• Rychlejší nasazení metody díky eliminaci nebo výraznému zkrácení kondicionační fáze.
• Vyšší obnova kyselých a fosforylovaných peptidů vede ke zvýšené citlivosti a lepšímu pokrytí při proteomických analýzách, zejména tam, kde je materiálu omezené množství.
• Čistší MS spektra s nižším základním šumem a menším množstvím artefaktů zvyšují spolehlivost identifikací a kvantifikací.
• Kompatibilita s mikroflow i běžnými analytickými UHPLC systémy usnadňuje integraci do existujících pracovních postupů v laboratořích zabývajících se phosphoproteomikou a QA/QC.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry a aplikace této třídy řešení:

• Rozšíření povrchových úprav pro minimalizaci adsorpce i jiných obtížných analyzátů (např. oligosacharidů, velmi hydrofobních peptidů).
• Integrace HPS kolón do workflow pro datově závislou i datově nezávislou akvizici (DDA/DIA) pro zlepšení hloubky proteomu a kvantitativní přesnosti.
• Další miniaturizace a optimalizace pro nanoLC aplikace, kde je dopad ztrát materiálu nejvíce kritický.
• Standardizace měření a metrik pro hodnocení adsorpce a kondicionace kolón v rámci laboratorních QC programů.
• Vývoj povrchových úprav odolných vůči dlouhodobému provozu a širokému spektru pufrů a přísad používaných v proteomice.

Závěr

Waters BioResolve Peptide C18 RP kolony s MaxPeak Premier (HPS) technologií poskytují konzistentně lepší obnovu a tvar píků kyselých a fosforylovaných peptidů už od první injekce, čímž snižují potřebu kondicionace a zlepšují kvalitu MS dat. Výhody platí pro 1 mm i 300 µm ID kolony a jsou přínosné pro aplikace v kapilární a mikroflow proteomice, kde je kritická citlivost a reprodukovatelnost.

Reference

1. Hanna CM, Koza SM, Addepalli B. Enhanced Recovery and Peak Shape of Acidic Peptides with BioResolve™ 1 mm ID Columns with MaxPeak™ Premier Technology. Waters Application Note 720009231, 2026.
2. Hanna CM, Koza SM, Addepalli B. Benchmarking Resolution and Recovery of BioResolve™ 1 mm ID C18 RP Columns with MaxPeak™ Premier Technology. Waters Application Note 720009274, 2026.