Increased Sensitivity for LC-MS Analysis of Phosphopeptides on an ACQUITY QDa Detector Using XSelect Premier Columns

Význam tématu

Analýza fosfopeptidů je klíčová pro studium buněčných signálních drah a proteomiky. Fosforylace ovlivňuje funkci a interakce proteinů, nicméně nízká abundančnost a tendence k adsorpci na kovové povrchy často snižují citlivost LC-MS měření. MaxPeak Premier Columns představují pokročilou technologii pro minimalizaci těchto ztrát a umožňují spolehlivější detekci i při použití běžných jednočtvercových hmotnostních detektorů.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace bylo porovnat tři chromatografické kolony při analýze standardu čtyř syntetických enolázových fosfopeptidů: konvenční XSelect Peptide CSH C18, konkurenční peptidová kolona a nové XSelect Premier Peptide CSH C18 s technologií MaxPeak HPS. Hodnocena byla citlivost, reproducibilita a návratnost analytu na ACQUITY UPLC H-Class systému spojeném s detektorem ACQUITY QDa.

Použitá metodika

Analýza probíhala v režimu ESI+ Full Scan, mobilní fáze A byla 0,1 % kyselina mravenčí ve vodě, fáze B 0,1 % kyselina mravenčí v acetonitrilu. Průtok 0,45 mL/min, teplota kolony 60 °C, objem injekce 1 µL. Srovnáním extrahovaných iontových chromatogramů a plošných integrálů se hodnotila citlivost a stabilita signálu během pěti po sobě následujících injekcí.

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC H-Class System
• ACQUITY QDa Mass Detector (ESI+ Full Scan)
• Empower 3 Feature Release 4 (chromatografie a MS software)
• MaxPeak Premier Peptide CSH C18 Column, 2.1×50 mm, 2.5 µm
• XSelect Peptide CSH C18 XP Column, 2.1×50 mm, 2.5 µm
• Konkurenční peptide kolona, 2.1×50 mm, 2.7 µm

Hlavní výsledky a diskuse

MaxPeak Premier Column dosáhla nejvyšší citlivosti pro všechny čtyři fosfopeptidy, zvláště pro obtížněji detekovatelný dvakrát fosforylovaný T43. Konvenční a konkurenční kolony vykazovaly nižší počáteční plošné integrály a pomalejší nárůst odezvy po několika injekcích. Premier kolona nabídla stabilní a reprodukovatelný signál již od první injekce bez nutnosti dalšího pasivizačního cyklu.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazně zvýšená citlivost pro nízce koncentrované fosfopeptidy
• Zkrácení doby přípravy kolony bez speciálních pasivačních postupů
• Vysoká reprodukovatelnost mezi injekcemi
• Možnost aplikace na standardní UPLC-MS platformy

Budoucí trendy a možnosti využití

Nasazení MaxPeak HPS technologie lze rozšířit na další třídy kyselých biomolekul (glykanů, metabolitů) a kombinovat s high-resolution MS pro hlubší proteomické studie. Dále se očekává optimalizace povrchových úprav pro ještě vyšší chemickou inertnost a širší kompatibilitu s tvrdšími mobilními fázemi.

Závěr

MaxPeak Premier Columns významně snižují ztráty fosfopeptidů na kovových površích a zvyšují citlivost LC-MS měření i na jednom kvadrupólu. To umožňuje detekci nižších koncentrací fosforylovaných peptidů bez kompromisů ve selektivitě nebo retenčním čase.

Reference

1. DeLano M, Walter TH, Lauber M, et al. Using Hybrid Organic-Inorganic Surface Technology to Mitigate Analyte Interactions with Metal Surfaces in UHPLC. Analytical Chemistry. 2021;93(13):5773–5781.
2. Waters Corporation. MassPrep Phosphopeptide Standard-Enolase Care and Use Manual. 715001599; 2021.