A Comprehensive, Curated, High‑Throughput Method for the Detailed Analysis of the Plasma Lipidome

Význam tématu

V posledních letech se díky pokročilým technikám lipidomiky, zejména kapalinové chromatografii spojené s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC–MS/MS), výrazně rozšířilo naše chápání lipidového profilu lidského plazmatu. Mapování lipidomu na úrovni populačních studií umožňuje odhalit souvislosti mezi metabolickými změnami lipidů a různými onemocněními, což je klíčové pro rozvoj nových diagnostických a preventivních strategií.

Cíle a přehled studie / článku

Autoři představují cílenou metodu založenou na trojitém kvadrupolu pro kvantifikaci 763 různých lipidových druhů z 10µl plazmy. Metoda kombinuje optimalizované extrakční postupy a dynamické MRM skenování, umožňuje analýzu jednoho vzorku za 16 minut (nebo 13 minut v režimu dvoukolonového systému) a je navržena pro vysokopropustné studie s tisíci vzorky.

Použitá metodika

Vzorky plazmy se náhodně rozřadily a do každé extrakce byly přidány vnitřní standardy (sestava stabilně značených i nefyziologických lipidů). Připravené vzorky se extrahovaly do směsi butanol–methanol (1:1) s 10 mM amonným formiátem, poté se odebraný supernatant odkapalnil na přibližně 200 µl a injektoval do LC–MS/MS. Metoda využívá:

• přesně nastavených retardací během chromatografického běhu
• dynamického režimu MRM pro zvýšení citlivosti
• rozsáhlých kontrol kvality s využitím plazmy NIST SRM 1950, plasmových QC a technických QC

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity/Infinity II kapalinový chromatograf
• Agilent 6495C trojitý kvadrupol s ionizačním zdrojem Jet Stream
• Softwarový balík Agilent MassHunter (verze 10.0 a vyšší)

Hlavní výsledky a diskuse

Reprodukovatelnost metody byla ověřena 50 po sobě jdoucími injekcemi technického QC agresivní směsi, přičemž průměrný koeficient variační (%CV) pro koncentrace lipidů se pohyboval kolem 5 %. Při analýze 2 500 plasmatových vzorků v šesti dávkách bylo dosaženo %CV do 10 % pro ~600 lipidů. Dynamické MRM umožnilo udržet krátké doby setrvání na tranzicích i při monitorování 665 MRM přechodů.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí vyvážený poměr mezi hloubkou pokrytí lipidomu (763 druhů, 44 tříd) a vysokou propustností (16–13 minut na vzorek). Díky standardizovanému použití NIST SRM 1950 lze data mezi různými laboratořemi snadno integrovat a porovnávat. Vnitřní standardy zajišťují relativní kvantifikaci a kompenzují matrikové efekty.

Budoucí trendy a možnosti využití

Pro další rozvoj se předpokládá:

• rozšíření metodiky na jiné biologické matrice (tkáně, buňky) s novými standardy
• zvýšení prostorového rozlišení lipidových izomerů pomocí longitudinálních aduktů či rozšířených gradientů
• automatizace extrakce v 96-well formátu pro ještě vyšší propustnost
• integrace výsledků do strojového učení pro biomarkerový screening

Závěr

Popisovaná LC–MS/MS metoda s dynamickým MRM nabízí robustní, vysoce reprodukovatelný nástroj pro podrobnou analýzu lipidomu v plastě. Je optimalizována pro velké populační a klinické studie, umožňuje rychlou přípravu i analýzu a standardizaci výsledků napříč laboratořemi.

Reference

• Huynh K. et al. High-Throughput Plasma Lipidomics: Detailed Mapping of the Associations with Cardiometabolic Risk Factors. Cell Chem. Biol. 2019, 26(1), 71–84.e4.
• Beyene H. B. et al. High-Coverage Plasma Lipidomics Reveals Novel Sex-Specific Lipidomic Fingerprints of Age and BMI: Evidence from Two Large Population Cohort Studies. PLoS Biol. 2020, 18(9), e3000870.
• Alshehry Z. H. et al. An Efficient Single Phase Method for the Extraction of Plasma Lipids. Metabolites 2015, 5(2), 389–403.
• Muniandy M. et al. A Semi-Automated Lipid Extraction Protocol Using the Agilent Bravo Automated Liquid Handling Platform. Agilent Technologies application note 5991-5724EN, 2015.
• Liebisch G. et al. Shorthand Notation for Lipid Structures Derived from Mass Spectrometry. J. Lipid Res. 2013, 54(6), 1523–1530.
• Fahy E. et al. A Comprehensive Classification System for Lipids. J. Lipid Res. 2005, 46(5), 839–861.
• Fahy E. et al. Update of the LIPID MAPS Comprehensive Classification System for Lipids. J. Lipid Res. 2009, 50, S9–14.