Multi-Omics for Plasma: A Three-in-One End-to-End Automated Sample Preparation and LC/MS Metabolomics, Lipidomics, and Proteomics Workflow

Význam tématu

Automatizovaná příprava vzorků a integrovaná LC-MS/MS analýza metabolomiky, lipidomiky a proteomiky nabízí komplexní přístup k charakterizaci změn v biologických systémech. Tato tří-ve-jednom strategie umožňuje detailní mapování metabolických drah, identifikaci biomarkerů režimu působení léčiv, odhalení vedlejších účinků a podporu vývoje personalizované medicíny.

Cíle a přehled studie

Cíl prezentované práce spočívá ve vývoji a validaci end-to-end automatizovaného pracovního postupu pro analýzu plazmy ve třech omických vrstvách. Studie demonstruje:

• Implementaci Bravo Metabolomics Sample Prep Platform a AssayMAP Bravo pro automatickou extrakci vzorků.
• Separaci a detekci více než 500 polarních metabolitů, 763 lipidů ve 44 třídách a 375 peptidů z myší plazmy.
• Využití Agilent Infinity II Bio LC a Evosep One pro standardní a nízkoprůtokové chromatografické metody.
• Nasazení triple kvadrupólového detektoru 6495D LC/TQ pro vysokou citlivost a rychlost analýzy.

Použitá metodika a instrumentace

Automatizovaná příprava vzorků:

• Bravo Metabolomics Sample Prep Platform s Captiva EMR-Lipid destičkami pro extrakci metabolitů a lipidů.
• AssayMAP Bravo pro enzymatickou digesci proteinů a přípravu peptidů.

Chromatografie:

• Agilent Infinity II Bio LC se standardním průtokem pro separaci lipidů (C18, 16 minut), polarních metabolitů (HILIC-Z, 24 minut) a peptidů.
• Evosep One pro nízkoprůtokové nano LC aplikace peptidů.

Detekce a kvantifikace:

• Agilent 6495D Triple Quadrupole LC/TQ s možností nastavení iFunnel parametrů (Fragile, Standard) pro optimalizaci citlivosti.
• MRM režimy s dobou dwell 0,5–5 ms pro měření stovek přechodů v jedné injekci.

Software pro analýzu dat:

• MassHunter Quant a Skyline pro kvantifikaci.
• Mass Profiler Professional s Pathway Architect pro statistiku a interpretaci drah.

Hlavní výsledky a diskuse

Reprodukovatelnost extrakce:

• Automatizovaná extrakce metabolitů snížila variační koeficienty (RSD) o ~50 % ve srovnání s manuálním postupem.

Kvantitativní výkon:

• Metabolity: více než 500 polarních sloučenin s RSD kolem 1–2 % při dwell 0,5 ms.
• Lipidy: 763 lipidů v 44 třídách se značnou dobrou reprodukovatelností v rozsáhlých kohortách (>3000 vzorků) a mezi laboratořemi (RSD <20 %).
• Peptidy: LLOQ pod 50 amol pro 74 % peptidů, s RSD <30 % pro 95 % sledovaných peptidů.

Optimalizace iFunnel:

• Nastavení Fragile zvýšilo citlivost pro vybrané metabolity (např. cis-akonitová kyselina o ~28 %).

Přínosy a praktické využití metody

• Komplexní analýza více omických vrstev bez nutnosti různé instrumentace.
• Vyšší reprodukovatelnost a průchodnost díky automatizaci přípravy vzorků.
• Možnost širokého rozsahu aplikací od objevování biomarkerů po cílené kvantifikace v klinickém a farmaceutickém výzkumu a QA/QC.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace dalších omických vrstev, např. glykomiky nebo nukleomiky.
• Další zvýšení automatizace a miniaturizace přípravy vzorků pro vzorkově úsporné a vysoce výkonné analýzy.
• Implementace umělé inteligence pro pokročilou analýzu dat a predikci biomarkerů.

Závěr

Prezentovaný tří-ve-jednom workflow ukazuje, že kombinace automatizované přípravy vzorků a triple kvadrupólového MS přináší vysokou citlivost, reprodukovatelnost a průchodnost pro multi-omické studie plazmy. Taková platforma umožňuje komplexní pohled na biologické dráhy a podporuje vývoj cílených klinických aplikací.

Reference

1. Van de Bittner GC et al. Agilent Application Note 5994-5065EN. 2022.
2. Sartain M et al. Agilent Application Note 5994-2156EN. 2020.
3. Yannell K et al. Agilent Application Note 5994-5628EN. 2023.
4. Wu L. Agilent Application Note 5994-2285EN. 2020.
5. Wu L. Agilent Application Note 5994-1928EN. 2020.
6. Huynh K et al. Agilent Application Note 5994-3747EN. 2021.
7. Van de Bittner GC et al. Poster ASMS 2024 TP-040.