Analytical Scale 96-well Protein A Affinity Resin-Based Purification using Andrew+ Automation Robot

Význam tématu

Purifikace monoklonálních protilátek pomocí Protein A ve formátu 96 jamek umožňuje rychlou a paralelní analýzu kritických kvality výstupů bioprodukce. Automatizace tohoto procesu zvyšuje průchodnost vzorků, minimalizuje riziko kontaminace a zajišťuje konzistentní výsledky v podpoře výzkumu i výrobního QA/QC.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a ověřit automatizovaný protokol pro preparativní Protein A purifikaci až 96 vzorků z kultivačního média (HCCF) pomocí robota Andrew+ a následné kvantitativní stanovení protilátek LC-UV analytickou metodou. Studie poskytuje kompletní workflow včetně dynamické volby počtu vzorků, neutralizace eluátu a LC-UV analýzy s NISTmAb standardem.

Použitá instrumentace

• Andrew+ Automation Robot
• ACQUITY Premier BSM LC-UV System
• Waters BioResolve Protein A Affinity Column MaxPeak Premier 2.1×20 mm
• waters_connect Software a OneLab
• Eppendorf shaker

Použitá metodika

Buňky NISTCHO exprimující mAb pěstované 14 dnů poskytly HCCF. Po odebrání a filtraci byla média rozdělena do 96jamek. Robot Andrew+ prováděl odpadnutí, navázání protilátek na ProA pryskyřici, mytí pufry a eluční kroky s glycinovým pufrem. Eluát byl neutralizován na pH 7,2 a shromážděn (100 μL) na další analýzu.

LC-UV analýza proběhla na ACQUITY Premier BSM se sloupcem BioResolve Protein A Affinity (průtok 0,75 mL/min, gradient 0–100 % formiové kyseliny/D PBS, teploty 25 °C/8 °C, detekce 280 nm, doba běhu 3 minuty). Vzorky se vstřikovaly ve dvou mikrolitrech v triplikátu.

Hlavní výsledky a diskuse

Calibration curve NISTmAb vykazovala lineární oblast 0,05–5 mg/mL s R2 = 0,998 a odchylkou <10 %. Chromatografické špičky byly úzké, s %RSD plochy špičky pod 1 %. Celková průměrná návratnost mAb z 96 jamek činila 96,8 ± 8,2 % s oscilacemi většinou v rozmezí ±10 % relativně k neočištěnému vzorku. Dynamický protokol umožnil čištění libovolného počtu vzorků od 1 do 96 za 75 minut pro celý formát.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká propustnost a paralelní příprava až 96 vzorků
• Robustní a reprodukovatelné výsledky s nízkým RSD
• Minimální riziko zbytkového carry-over díky gradientnímu propírání
• Eluát vhodný pro následné CQA analýzy

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodu lze rozšířit o integraci s designem experimentu v multibioreaktorech, online detekci, adaptaci na jiné affinity ligandy a miniaturizaci pro ještě vyšší propustnost. Plánuje se také propojení s MS detekcí pro detailnější charakterizaci mAb.

Závěr

Automatizovaný protokol Protein A purifikace pomocí Andrew+ Robot a OneLab poskytuje rychlou, spolehlivou a snadno dostupnou metodu pro high-throughput čištění monoklonálních protilátek v 96jamečném formátu. Protokol je volně stažitelný a umožňuje uživatelům optimalizovat workflow upstream bioprocesů.

Reference

1. Alelyunas Y W, Wushensky J, Wrona M, Chen R. Analytical Scale 96-well Protein A Affinity Resin-Based Purification using Andrew+ Automation Robot Supporting Upstream Bioprocessing. Waters application note 720009002, 2025.
2. Koza S M, Hanna C M, Jiang A H W, Yu Y Q. Automated High-Throughput Analytical-Scale Monoclonal Antibody Purification Using Production-Scale Protein A Affinity Chromatography Resin. Waters application note 720007861.
3. Koza S M, Shiner S, Lauber M A. Lowering Quantitation Limits for mAb Titer Measurements Using Small Volume 3.5 μm Particle-Size Protein-A Affinity Columns. Waters application note 720008775.