Automated High-Throughput Analytical- Scale Monoclonal Antibody Purification Using Production-Scale Protein A Affinity Chromatography Resin

Význam tématu

Purifikace monoklonálních protilátek (mAb) z kultivačních médií se používá k odstranění interferujících složek a umožňuje přesné analýzy kvality a stability přípravku. Vysoká propustnost a automatizace zvyšují efektivitu práce i reprodukovatelnost výsledků.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout automatizovanou analytickou purifikaci 120–240 µg mAb pomocí procesní Protein A pryskyřice v 96-well filtrací destičce. Metoda minimalizuje množství vzorku, maximalizuje výtěžek a koncentraci finálního eluátu a zkracuje dobu přípravy pro 48 vzorků na přibližně 1 hodinu.

Použitá metodika

Postup zahrnoval 12 pipetovacích kroků a 4 inkubační kroky. Po přidání Protein A pryskyřice do kultivačního média probíhala 20min inkubace na orbitálním mixéru (1250 RPM, 8 °C). Následovalo promytí, eluce 100 mM glycin pH 3.0 a neutralizace 1 M Tris pH 7.5 v poměru 1:9.

Použitá instrumentace

• Andrew+ Pipeting Robot s Extraction+ modulem
• Pall AcroPrep Advance 96-well Filter Plate (0,2 µm)
• Waters QuanRecovery 700 µL 96-well plate
• Orbital shaker Eppendorf ThermoMixer C (8 °C)
• UPLC systém ACQUITY Premier s TUV detekcí a BioAccord LC-MS (ESI-ToF)
• Software OneLab a Empower 3

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosahuje výtěžnosti ≥85 % při naložení 120 µg mAb a ≥94 % při 240 µg. Nižší titry (0,5 µg/µL) vyžadují opakované naložení nebo více pryskyřice. Artefaktální formace multimer se zvýšila při pH ≤3.0, proto byl vybrán glycin pH 3.0.
Reprodukovatelnost (n=8) ukázala výtěžnost ≥90 % pro vzorky v PBS i z CHO média. Metoda efektivně odstraňuje hostitelské proteiny, což potvrdila analýza SEC a LC-MS glykanové profilování s detekcí hlavních glykoforem a mírným zvýšením M5.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká propustnost: purifikace 48 vzorků za ~1 hodinu
• Minimální množství vzorku (60–480 µg) s vysokým výtěžkem
• Flexibilita volby procesní pryskyřice (Protein A, G nebo L)
• Kompatibilita se SEC, glykanovou analýzou a dalšími metodami
• Snižuje chybovost a pracovní náročnost analytika

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodu lze rozšířit na vyšší zatížení až 480 µg a různé typy pryskyřic. Další optimalizace kroků praní a pH může zlepšit odstranění hostitelských proteinů a kvantitativní obnovu HMWS. Integrace pokročilých automatizačních platforem a strojového učení může zkrátit dobu vývoje a zvýšit robustnost procesů.

Závěr

Automatizovaná analytická purifikace mAb pomocí procesní Protein A pryskyřice prokázala vysokou výtěžnost, reprodukovatelnost a účinné odstranění rušivých složek. Metoda zkracuje dobu přípravy vzorků a umožňuje bezproblémové navazující SEC a glykanová měření.

Reference

• Hopp J et al. Development of a High Throughput Protein A Well-Plate Purification Method. Biotechnol Prog. 2009;25(5):1427–32.
• Coffman JL et al. High‐Throughput Screening of Chromatographic Separations. Biotechnol Bioeng. 2008;100(4):605–618.
• Bergander T et al. Determination of Dynamic Binding Capacity Using Microtiter Filter Plates. Biotechnol Prog. 2008;24(3):632–639.
• Koza SM et al. Rapid SEC-UV Analysis of Monoclonal Antibodies. Waters Appl Note 720007852. 2022.
• Dunn ZD et al. Two-dimensional Protein-A SEC of Monoclonal Antibodies. MAbs. 2020;12(1):1702263.
• Jones M et al. “High‐Risk” Host Cell Proteins: A Multi‐Company Collaborative View. Biotechnol Bioeng. 2021;118(8):2870–2885.
• Hanna CM et al. Automated High-Throughput N-Glycan Labelling and LC-MS Analysis. Waters Appl Note 720007854. 2023.