High-Throughput Native HRMS ProA-MS Analysis of mAb Variants in Cell-Culture Samples

Význam tématu

Monoklonální protilátky jsou klíčové bioterapeutické látky, u kterých je nezbytné sledovat jejich čistotu, strukturu a koncentraci během vývoje i výroby.
Rychlé a citlivé metody umožňují v reálném čase detekovat drobné variace a optimalizovat proces výroby.

Cíle a přehled studie

Stanovit postup ProA-MS na platformě ACQUITY UPLC a Xevo G3 QTof pro přímou analýzu intact mAb ve filtrovaných vzorcích buňkami kultivovaného filtru (CCCF).
Optimalizovat 1minutové eluční gradienty pro vysokou propustnost a použít A280 UV detekci pro rychlé stanovení titru produktu v CCCF.

Použitá metodika

Vzorky: referenční NISTmAb a CCCF obsahující trastuzumab.
Mobilní fáze: 100 mM amoniumacetát (naložení) a 200 mM kyselina mravenčí (eluce).
Gradient: strmá změna pH s průtokem 0,20 ml/min.
Teploty: kolona při pokojové teplotě, vzorek při 6 °C.
Objem injekce: 2–20 µg nálože u NISTmAb, odpovídající koncentracím 10 mg/ml a 1 mg/ml v CCCF.
Data: UNIFI Application a waters_connect Platform.

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC se Sample Managerem, FTN a TUV detektorem (5 mm flow cell)
• BioResolve™ Protein A Affinity Column, MaxPeak™ Premier, 3,5 µm, 2,1 × 20 mm
• Xevo™ G3™ QTof Mass Spectrometer
• Software: UNIFI Application, waters_connect Platform

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza NISTmAb (5 µg) ukázala srovnatelnou A280 odezvu pro vzorky neat i CCCF, avšak nižší ionizační efektivitu u CCCF v XIC v důsledku matrice.
Natívní MS spektra pro obě matice potvrdila detekci nízkoodběrových singly glykozylovaných variant s hmotnostní chybou <20 ppm.
Varianty identifikované dříve v NIST mezilaboratorní studii byly potvrzeny za náloží 2–20 µg, přičemž nejnižší úrovně vyžadovaly ≥5 µg.
Stanovení titru přes A280 vykázalo lineární odpověď s odchylkami pod ±0,4 % a průměrnou obnovou 105 % pro CCCF, s mírnou interferencí matrice.

Přínosy a praktické využití metody

• Úplná analýza intact mAb a variant za 4 minuty bez předchozího čištění vzorku
• Vysoké rozlišení a citlivost HRMS pro detekci makromolekulárních heterogenit
• Současné stanovení titru produktu pomocí UV detekce na 280 nm

Budoucí trendy a možnosti využití

Další optimalizace mobilních fází a parametrů LC/MS pro zvýšení citlivosti v komplexních maticích.
Rozšíření aplikace na jiné Fc-konstruované proteiny a fúzní proteiny.
Integrace metody do on-line monitoringu výroby v režimu Quality by Design.

Závěr

Komplexní ProA-MS metoda s vysokou propustností a rychlým gradientem umožňuje spolehlivou identifikaci intact mAb variant a současné stanovení titru přímo z CCCF vzorků během 4 minut.
Metoda zkracuje dobu analýzy i množství přípravných kroků a poskytuje vysoce reprodukovatelné výsledky s potenciálem pro rozšířené nasazení v bioprodukční výrobě.

Reference

1. Dunham WH, Mullin M, Gingras AC. Affinity-purification coupled to mass spectrometry: Basic principles and strategies. Proteomics. 2012;12(10):1576–1590.
2. Jakes C, et al. Rapid analysis of biotherapeutics using protein A chromatography coupled to orbitrap mass spectrometry. Anal Chem. 2021;93(40):13505–13512.
3. Cotham VC, et al. A generic platform to couple affinity chromatography with native mass spectrometry for the analysis of therapeutic monoclonal antibodies. J Pharm Biomed Anal. 2023;228:115337.
4. Koza SM, Shiner S, Lauber MA. A Trap & Elute Style 2D Protein A–SEC Heart-Cut Method for the Analysis of Monoclonal Antibody Titer and Size Variants in Cell Culture. Waters Application Note. 720008902;2025.
5. Koza SM, et al. An Easy-to-Execute Direct-Connect 2D Protein A–SEC Method for the Analysis of Monoclonal Antibody Titer and Size Variants in Cell Culture. Waters Application Note. 720008780;2025.
6. Koza SM, et al. Extended Gradients with Efficient Protein A Columns for the ProA-MS Analysis of mAb and msAb Variants. Waters Application Note. 720009041;2025.
7. Formolo T, et al. Determination of the NISTmAb primary structure. In: State-of-the-art and emerging technologies for therapeutic monoclonal antibody characterization. Vol 2. American Chemical Society;2015. p.1–62.
8. Koza SM, Shiner S, Lauber MA. Lowering Quantitation Limits for mAb Titer Measurements Using Small Volume 3.5 µm Particle-Size Protein-A Affinity Columns. Waters Application Note. 720008775;2025.