Extended Gradients with Efficient Protein A Columns for the ProA-MS Analysis of mAb and msAb Variants

Význam tématu

Rychlá a přesná charakterizace monoklonálních protilátek (mAb) a multispecifických protilátek (msAb) přímo z produktových vzorků buněčných kultur je klíčová pro biotechnologický vývoj. Kombinace vysoce efektivních Protein A (ProA) afinitních kolon s elucí v prodloužených gradientních módech a vysokorozlišovacím hmotnostním spektrometrem (HRMS) umožňuje souběžné stanovení intact mass, relativního zastoupení variant i titru produktu bez nutnosti předchozího čištění.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo ověřit, že použití 2,1×20 mm ProA kolony BioResolve Protein A MaxPeak Premier (3,5 µm) s prodlouženými pH-gradienty ve spojení s Xevo G3 QTof HRMS a UV detekcí při 280 nm poskytne:

• Identifikaci intact mas oddělených variant mAb a msAb.
• Stanovení relativního podílu variant a titru na základě A280.
• Možnost přímé analýzy nezpracovaných CCCF vzorků.

Použitá metodika

Pro separaci byl nasazen pH gradient mezi 100 mM amonným acetátem (nátěr) a 200 mM kyselinou mravenčí (eluce) při průtoku 0,20 mL/min. Eluát byl rozdělen mezi UV detektor (280 nm) a QTof HRMS (rozsah 400–8000 m/z, sken 1 s, 2 kV), bez kolizní energie. Metodu testovali na referenčním NISTmAb a na mock msAb (dvoubodová mutace ve Fc), oba jako čisté roztoky i ředěné 1:9 resp. 1:1 v CCCF.

Použitá instrumentace

• LC: ACQUITY UPLC s BSM, FTN a TUV 280 nm.
• Kolona: Waters BioResolve Protein A Affinity Column, MaxPeak Premier, 3,5 µm, 2,1×20 mm.
• MS: Xevo G3 QTof Mass Spectrometer.
• Software: UNIFI a waters_connect.

Hlavní výsledky a diskuse

1. Oxidované varianty NISTmAb se oddělily jako časně eluující špička (Δ+16 Da) s obsahem 1,2–1,4 % dle A280, a to jak v čistém vzorku, tak v CCCF. HRMS potvrdila masové posuny a naznačila změnu N-glykanační distribuce.
2. U mock msAb byly rozlišeny tři varianty HCnHCn, HCnHCm a HCmHCm (Δ3,05 Da), s konzistentními relativními abundancemi napříč koncentracemi a v CCCF.
3. Kalibrace A280 vykázala lineární závislost (R2>0,99) a obnovy 96–102 % pro titerové stanovení obou vzorků.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost přímé analýzy produktů z buněčných kultur bez předchozího čištění.
• Paralelní stanovení intact mass, variantních podílů a titru v jednom běhu.
• Detekce nízkoabundentních degradantů (oxidace, HC pairing).
• Šetření vzorku díky nízkému průtoku a objemu injekce.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření ProA-MS přístupu na další Fc-proteiny a fusion proteiny, integrace s 2D chromatografií pro detailní PTM charakterizaci, řešení vysokoprůtokových formátů pro screening, a využití pokročilých softwarových nástrojů pro automatizovanou analýzu velkých datových souborů.

Závěr

Prodlužované gradientní eluce na vysoce efektivních Protein A kolonách v kombinaci s UV a HRMS detekcí představují robustní platformu pro komplexní charakterizaci mAb a msAb přímo z CCCF. Metoda poskytuje podrobné informace o intact mass, variantách vzniklých oxidací či mutacemi a zároveň umožňuje přesné stanovení titru.

Reference

1. Dunham W. H., Mullin M., Gingras A.-C. Affinity-purification coupled to mass spectrometry: Basic principles and strategies. Proteomics 12(10):1576–1590, 2012.
2. Jakes C. et al. Rapid analysis of biotherapeutics using protein A chromatography coupled to orbitrap mass spectrometry. Analytical Chemistry 93(40):13505–13512, 2021.
3. Cotham V. C. et al. A generic platform to couple affinity chromatography with native mass spectrometry for the analysis of therapeutic monoclonal antibodies. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 228:115337, 2023.
4. Gaza-Bulseco G. et al. Effect of methionine oxidation of a recombinant monoclonal antibody on the binding affinity to protein A and protein G. Journal of Chromatography B 870(1):55–62, 2008.
5. Koza S. M., Shiner S. J., Lauber M. A. A Trap & Elute Style 2D Protein A–SEC Heart-Cut Method for the Analysis of Monoclonal Antibody Titer and Size Variants in Cell Culture. Waters Application Note 720008902, 2025.
6. Koza S. M. et al. An Easy-to-Execute Direct-Connect 2D Protein A–SEC Method for the Analysis of Monoclonal Antibody Titer and Size Variants in Cell Culture. Waters Application Note 720008780, 2025.
7. Koza S. M., Shiner S. J., Lauber M. A. Lowering Quantitation Limits for mAb Titer Measurements Using Small Volume 3.5 µm Particle-Size Protein-A Affinity Columns. Waters Application Note 720008775, 2025.