Simultaneous Analysis of Food Allergens, Including Nuts and Fruits, Using a Triple Quadrupole Mass Spectrometer

Význam tématu

Rostoucí výskyt potravinových alergií vyžaduje přesné a spolehlivé metody pro detekci alergenů v potravinách. LC–MS/MS umožňuje multiplexní analýzu více alergenů najednou s vysokou selektivitou díky sledování specifických peptidů. Tato vlastnost významně přispívá k bezpečnosti spotřebitelů a usnadňuje splnění přísných národních i mezinárodních předpisů o označování alergenů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem publikované aplikace bylo vyvinout a ověřit LC–MS/MS metodu pro simultánní stanovení sedmi přímo regulovaných alergenů v Japonsku a deseti alergenů jim ekvivalentních. Studie představuje:

• Výběr a optimalizaci specifických peptidů a MRM přechodů pro čtyři ořechy (vlašský, mandlový, kešu, makadamový) a pět plodů (banán, kiwi, pomeranč, broskev, jablko).
• Přípravu kalibračních křivek od 1 ppm.
• Analýzu vyspikovaných potravinových vzorků a hodnocení specificity, linearity a detekovatelné mezní koncentrace.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu standardů a vzorků se používaly následující kroky:

• Extrahování alergenových proteinů pomocí specializovaného extrakčního činidla.
• Redukce disulfidických vazeb (DTT) a alkylace cysteinů (IAA).
• Enzymatická digesce trypsinem.
• Čištění peptidů na SPE kolonce a koncentrace odpařovačem.
• Filtrace vzorků v 0,1% kyselině mravenčí před vstřikem do LC–MS/MS.
• Vývoj a optimalizace MRM přechodů za pomoci softwaru Skyline a dat z DDA měření.

Použitá instrumentace

• UHPLC systém Nexera X3 (Shimadzu)
• Shim-pack GIST-HP C18 kolona (100×2,1 mm, 3 µm)
• Q-TOF spektrometr LCMS-9030 pro získání MS/MS dat v DDA režimu
• Triple kvadrupólový spektrometr LCMS-8060RX pro kvantitativní MRM analýzu
• Softwarové nástroje: Skyline pro návrh přechodů, MS Amanda pro identifikaci peptidů, BCA metoda pro stanovení proteinové koncentrace

Hlavní výsledky a diskuse

Byly úspěšně vyvinuty nové MRM přechody pro cílové peptidy všech sledovaných alergenů s výjimkou pomeranče, kde bylo pozorováno průnikové signály. Specifičnost přechodů byla ověřena analýzou 17 alergenových extraktů, přičemž u většiny peptidů nebyly pozorovány falešně pozitivní špičky nebo byly pod úrovní 1 %. Kalibrační křivky v matici bez alergenů vykázaly v rozsahu 1–10 mg/kg vynikající linearitu (R²>0,995). Testy na modelovém vzorku kuřecího rizota potvrzují kvantitativní schopnost metody.

Přínosy a praktické využití metody

Multiplexní LC–MS/MS přístup nabízí:

• Simultánní stanovení až 17 alergenů v jediném běhu.
• Vyšší selektivitu než ELISA či PCR díky sledování aminokyselinových sekvencí.
• Možnost kvantifikace na úrovni jednotek ppm.
• Redukci počtu různých analytických sad a úsporu pracovní i časové náročnosti v laboratoři.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další směřování výzkumu může zahrnovat rozšíření panelu alergenů o další potravinové zdroje, optimalizaci extrakčních protokolů pro různé matrice, zavedení vysokoprůchodových pracovních postupů a využití nových datově řízených přístupů pro automatizovanou interpretaci výsledků. Kombinace s pokročilými bioinformatickými nástroji umožní rychlejší a přesnější monitoring alergenů v globálním potravinovém řetězci.

Závěr

Vyvinutá LC–MS/MS metoda pro simultánní analýzu 17 potravinových alergenů splňuje požadavky na vysokou selektivitu, citlivost a kvantitativní spolehlivost. Tento postup představuje efektivní nástroj pro oblasti QA/QC, potravinářský výzkum i regulační kontrolu a přispívá k vyšší ochraně spotřebitelů s potravinovými alergiemi.