Multi-Allergen Detection: Determining Unique Nut and Tree Nut Peptide Markers Using Accurate-Mass Q-TOF LC/MS

Význam tématu

Skrytá přítomnost ořechových alergenů v potravinách může vést k závažným anafylaktickým reakcím. Tradiční imunologické testy (ELISA) často selhávají u tepelně opracovaných výrobků a PCR nedokáže detekovat skutečný protein. Použití LC-MS/MS proteomického přístupu umožňuje spolehlivě identifikovat peptidové markery na sub-ppm úrovni v jediném robustním testu.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem bylo vyhledat a ověřit unikátní peptidové markery pro 11 druhů stromových ořechů (mandle, pekan, kešu, vlašské ořechy, lískové ořechy, piniové ořechy, para ořechy, makadamie, pistácie, kaštany, kokos) a arašídy. Po enzymatické digesci trypsinem byly produkty analyzovány přes Q-TOF LC/MS a sekvence ověřeny databázovým vyhledáváním proti NCBI nr, aby se zajistila specifita vůči jiným potravinovým komponentám.

Použitá metodika a instrumentace

Postup přípravy vzorku:

• Výběr surových a pražených ořechů zakoupených v obchodě.
• Extrahování proteinů 30 mg vzorku ve 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) při 50 °C / 2 h.
• Digesce trypsinem (Sigma T8003) po 2 h, ukončení reakce a centrifugace.

Chromatografie a hmotnostní spektrometrie:

• LC: Agilent 1290 Infinity, kolony Poroshell 300/120 C18 (2,1×75 mm a 2,1×50 mm, 2,7 µm).
• Mobilní fáze A/B: voda/acetonitril 95/5 a 5/95 s 0,025 % TFA; gradienty pro proteiny i peptidy.
• MS: Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF s Jet Stream ESI, pozitivní ionizace, rozšířený dynamický rozsah.
• Software: MassHunter Workstation (B.05.01), Spectrum Mill (B.04.00.127).

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza intact proteinů ukázala, že pražením dochází ke zvýšení molekulové hmotnosti o 1–20 kDa v důsledku glykačních a Maillardových produktů. Workflow výběru peptidů:

1. Spektrální vyhledávání s tolerancí 20 ppm (prekurzor), 50 ppm (produkt) potlačilo falešné nálezy.
2. Výběr nejintenzivnějších peptidů se shodnou oblastí mezi syrovými a praženými vzorky (≤ 20 % rozdíl).
3. Ověření unikátnosti vůči ostatním ořechům a obilovinám (NCBI nr green plant).
4. Validace syntetickými standardy a potvrzení dvou potvrzovacích fragmentů MS/MS.

Peptidové markery (2 pro každou ořechovou skupinu, 4 pro arašídy) nevykazují interferenci v obilovinách (ječmen, kukuřice, rýže, quinoa, sója, pšenice). Při testování na reálných potravinách byly markery detekovány u výrobků deklarujících konkrétní ořech, u výrobků pražených na společném zařízení došlo k doplňkové detekci dalších ořechů.

Přínosy a praktické využití metody

• Jedna analýza pro 12 alergenů, snížení falešných pozitiv/negativ oproti ELISA.
• Citlivost sub-ppm, vysoká specifita díky databázovému ověření.
• Možnost aplikace v QA/QC potravinářských provozů pro spolehlivé značení výrobků.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metody o kvantitativní MRM přístupy na QQQ MS pro vyšší průtok.
• Integrace širších databází potravinových proteinů a typů zpracování.
• Automatizace přípravy vzorků a multiplexní screening dalších alergenů (mléko, vejce, sója).

Závěr

Proteomický přístup s Q-TOF LC/MS umožňuje spolehlivou jednorázovou detekci a identifikaci specifických peptidových markerů pro 11 stromových ořechů a arašídy v surových, pražených i zpracovaných potravinách. Metoda minimalizuje falešné nálezy, nabízí vysokou citlivost a specifitu a může významně zlepšit kontrolu alergenů v potravinářském průmyslu.

Reference

1. Crespo J.F. a kol. Food allergy: nuts and tree nuts. Brit. J. Nutr. 96(S2), S95 (2007).
2. Sicherer S.H., Sampson H.A. Food allergy. J. Allergy Clin. Immunol. 125(2 Suppl), S116–S125 (2010).
3. Bock S.A. a kol. Further fatalities caused by anaphylactic reactions to food. J. Allergy Clin. Immunol. 119(4), 1016–1018 (2007).
4. Poms R.E., Klein C.L., Anklam E. Methods for allergen analysis in food: a review. Food Addit. Contam. 21(1), 1–31 (2004).
5. van Hengel A.J. Food allergen detection methods and the challenge to protect food‐allergic consumers. Anal. Bioanal. Chem. 389(1), 111–118 (2007).
6. Cucu T. a kol. Detection of Hazelnut in Foods Using ELISA. J. AOAC Int. 95(1), 149–156 (2012).
7. Faeste C.K. a kol. Liquid chromatography and mass spectrometry in food allergen detection. J. Food Prot. 74(2), 316–345 (2011).
8. Picariello G. a kol. The frontiers of mass spectrometry‐based techniques in food allergenomics. J. Chromatogr. A 1218(42), 7386–7398 (2011).
9. Sealey-Voyksner J., Zweigenbaum J., Voyksner R. Discovery of Highly Conserved Unique Nut and Tree Nut Peptides by LC/MS/MS for Multi-Allergen Detection. Food Chemistry (2015).