Advancing Chromatographic Performance in Peptide Mapping

Význam tématu

Peptidové mapování je klíčovou metodou v biopharmaceutickém vývoji pro potvrzení sekvence bílkovin a identifikaci post-translačních modifikací. Interakce analyty-kov mezi kovy v LC hardware mohou významně snižovat citlivost a kvalitu separace, zejména u nabitých a fosforylovaných peptidů. Použití inertních kolón minimalizuje nežádoucí adsorpci a zlepšuje reprodukovatelnost dat.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie bylo porovnat chromatografický výkon Agilent Altura ZORBAX Eclipse Plus C18 inertní kolony a konvenční Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 SS kolony při LC/MS analýze syntetických mAb peptidů a trypsinem natráveného vzorku Herceptin. Studie hodnotí stabilizaci signálu, tvar píku, rozlišení PTM variant a sekvenční pokrytí.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky:syntetická směs peptidů obsahující sekvence monoklonálních protilátek a Herceptin digesovaný trypsinem (poměr protein:enzym 50:1). Čištění vzorku provedeno C18 spin kolónou pro odstranění nečistot.

• Kolony: Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18, 2.1×150 mm, 1.8 μm; Agilent Altura ZORBAX Eclipse Plus C18 inertní kolona, 2.1×150 mm, 1.8 μm.
• LC systémy: Agilent 1290 Infinity II Bio LC (High-Speed Pump, Multisampler, Multicolumn Thermostat).
• MS detektor: Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF v režimu pozitivní ESI, MS1 rozsah m/z 100–3000, MS/MS Auto mode, CID fragmentace.

Hlavní výsledky a diskuse

• Stabilizace signálu: Altura kolona dosáhla plateau relativní plochy píku do několika injekcí, zatímco SS kolona vyžadovala až 10–20 injekcí.
• Tvar piků: Pro hydrofobní/zásadité peptidy (např. VVSVLTVLHQDWLNGK) Altura inertní hardware dosáhl průměrného tailing faktoru 1,3 vs. 1,7 u SS kolony.
• Rozlišení deamidovaných variant: Inertní kolona umožnila jasné oddělení deamidovaného a nativního peptidu s rozdílem v retenčním čase ~0,16 min.
• Sekvenční pokrytí Herceptinu: 87,0 %, ztráty krátkých hydofilních peptidů pravděpodobně způsobené krokem C18 clean-upu.
• MS/MS potvrdilo lokalizaci deamidace na konkrétní pozici díky kvalitnímu chromatografickému rozlišení.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda zlepšuje citlivost, reprodukovatelnost a rozlišení obtížných PTM, umožňuje vyšší propustnost laboratoře a snižuje spotřebu rozpouštědel. Významné využití ve vývoji mAb, QC analýzách a rozsáhlých screeningových programech.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Optimalizace gradientních programů pro ještě lepší separaci složitých směsí.
• Rozšíření inertních technologií na analýzy fosforylace, glykozylace a dalších modifikací.
• Integrace do vysoce automatizovaných a multi-dimenzionálních LC/MS platform pro vysokopropustné aplikace.

Závěr

Agilent Altura ZORBAX Eclipse Plus C18 inertní kolona prokázala významné zlepšení chromatografické výkonnosti oproti standardnímu kovovému hardware, zejména u hydrofobních, zásaditých a modifikovaných peptidů. Tato technologie přináší robustnější a rychlejší metodu pro detailní peptidové mapování v biopharmaceutickém výzkumu.

Reference

1. Hsiao J.; et al. Pushing the Boundaries of Chromatographic Separation with Inert HPLC Column Hardware. Agilent Technologies application note 5994-8618EN, 2025.
2. Vanluchene H.; et al. mRNA Mapping with IO-RPLC-MS on a Low-Adsorption Flow Path. Agilent Technologies application note 5994-8055EN, 2025.
3. Feith A. Robust and Reliable Peptide Mapping. Agilent Technologies application note 5994-2718EN, 2024.
4. Sciuto S. Peptide Mapping of Trastuzumab Tryptic Digests on an Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF. Agilent Technologies application note 5994-7969EN, 2024.