Automated Workflow for Peptide Mapping of Pembrolizumab on the Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF

Význam tématu

Peptidové mapování monoklonálních protilátek je klíčové pro zajištění bezpečnosti, účinnosti a konzistence biofarmaceutických produktů. Umožňuje potvrdit primární sekvenci, lokalizovat post‑translační modifikace (PTM) jako glykozylace, oxidace či deamidace a mapovat disulfidové vazby. Automatizované, reprodukovatelné workflow zvyšuje průchodnost laboratoře a snižuje variability způsobené manuální přípravou vzorků, což je zásadní při monitorování kritických kvalitatívních atributů (CQA) během vývoje a výroby.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo předvést integrované end‑to‑end workflow pro peptidové mapování pembrolizumabu zahrnující automatizovanou přípravu vzorku, reverse‑phase LC separaci, vysoko‑rozlišovací LC/Q‑TOF akvizici a automatizovanou interpretaci dat. Studie měla ověřit: potvrzení kompletní sekvence, identifikaci a lokalizaci cílené mutace S228P, analýzu oxidací (Met) v nízké abundanci a kompletní mapu disulfidových vazeb.

Použitá metodika a instrumentace

Postup vzorkování:

• Výchozí koncentrace pembrolizumabu: 25 mg/mL; vzorky na mapování na 6 mg/mL.
• Pro redukovanou analýzu: 5 µL 6 mg/mL protilátky + 10 µL denaturačního/redukčního roztoku obsahující DTT; pro non‑redukovanou verzi stejný roztok bez DTT.
• Heat denaturace: 70 °C, 5 min; následná enzymatická štěpnost trypsinem (trypsin 15 ng/µL): doba inkubace 37 °C, 45 min. Vše automatizováno na Agilent AssayMAP Bravo.
• Po přípravě byly digesty analyzovány LC/MS/MS s náloží 2,5 µg peptidek a injekčním objemem 10 µL.

Instrumentace (výčet):

• Agilent AssayMAP Bravo Protein Sample Prep pro automatizovanou redukci/denaturaci, digest a čištění.
• Agilent 1290 Infinity III bio LC (multisampler, high‑speed pump, multicolumn thermostat).
• Kolona: Agilent Altura Peptide Plus, 2.1 × 150 mm, 2.7 µm; průtok 0.4 mL/min; teplota kolony 50 °C; mobilní fáze A = 0.1% FA ve vodě, B = 0.1% FA v acetonitrilu; gradient 2 % → 40 % → 80 % B dle protokolu; počáteční diverze proudu do odpadu prvních 3 min ke snížení ion‑suppression.
• Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q‑TOF s Dual JetStream ESI: zdrojové podmínky ~350 °C (gas), 11 L/min drying gas, 275 °C sheath gas, 12 L/min; capilární napětí 4 500 V; skimmer 45 V; fragmentor 175 V.
• MS parametry: MS1 rozsah 200–3 000 m/z (1 spektrum/s), MS2 50–3 000 m/z (0.5 spektra/s), izolační šířka ~4 m/z, DDA: 1 prekurzor/cyklus, prah 1 000 counts, izotopní model pro peptidy a preference nábojů 2>3>[>3]>1.
• Software: Agilent MassHunter pro akvizici a Agilent MassHunter BioConfirm 12.1 pro automatizované vyhledávání peptidů, mapování disulfidů a kvantifikaci modifikací; VWorks pro workflow management.

Hlavní výsledky a diskuse

Úspěšně dosažené kompletní (100 %) sekvenční pokrytí pembrolizumabu po trypsinovém štěpení, včetně jasného potvrzení N‑ a C‑terminálních peptidů pro lehký i těžký řetězec. Potvrzeno bylo i záměrné bodové záměny S228P v oblasti Fc‑hinge; MS/MS fragmentace umožnila jednoznačnou sekvenční identifikaci peptidu obsahujícího prolin na pozici 228.

Analýza oxidace: Met‑oxidace byla lokalizována na vybraném peptidu DTLMISR (HC 249–255/obsahující Met252). Oxidovaný a nativní izomer byly chromatograficky separovány a potvrzeny MS/MS změnou fragmentů (např. posun y‑ionů o +16 Da). Kvantifikace ukázala nízký, ale detekovatelný podíl oxidace, což demonstruje citlivost systému pro nízkofrekvenční PTM.

Disulfidové mapování: Ve non‑redukovaném režimu byly detekovány všechny teoreticky očekávané disulfidové páry (16 vazeb – 12 intrachain, 4 interchain). BioConfirm generoval všechny teoretické disulfidicky vázané peptidy a koreloval je s EIC signály; extrahované iontové chromatogramy 16 párů byly přehledně lokalizovány v chromatogramu.

Přínosy a praktické využití metody

• Automatizovaná příprava na AssayMAP Bravo snižuje variabilitu a hands‑on čas, umožňuje vysokou propustnost a reprodukovatelnost v rutině QC nebo výzkumu.
• Kombinace robustní RP‑LC metody s 6545XT Q‑TOF poskytuje vysokou sekvenční pokrytí a kvalitní MS/MS spektra i pro nízkoabundantní modifikace.
• Schopnost současně prokázat primární sekvenci, bodové mutace, oxidace a kompletní disulfidový vzorec dělá workflow vhodným pro kontrolu CQA během vývoje a lotové kontroly.

Budoucí trendy a možnosti využití

Automatizace a integrace přípravy vzorků s pokročilou datovou analýzou bude nadále růst, zejména v oblastech vysokopropustné kontroly kvality a characterizace biosimilars. Očekává se širší nasazení algoritmů pro hlubší identifikaci PTM (glykanové izomery, oxidace s lokalizací, nízkoabundantní truncace) a využití vyšších rychlostí a rozlišení Q‑TOF/Orbitrap současně s AI‑řízenou interpretací dat pro zvýšení přesnosti a automatizace zpráv.

Závěr

Prezentované workflow dokázalo spolehlivě poskytnout kompletní peptidové mapování pembrolizumabu včetně potvrzení zamýšlené S228P mutace, lokalizace Met‑oxidace v nízké abundanci a úplného mapování disulfidových vazeb. Kombinace automatizované přípravy, robustní chromatografie a výkonného LC/Q‑TOF s pokročilým softwarovým vyhodnocením představuje účinný nástroj pro charakterizaci mAb v akademickém i průmyslovém prostředí.

Reference

1. Li X.; et al. High Throughput Peptide Mapping Method for Analysis of Site‑Specific Monoclonal Antibody Oxidation. J. Chromatogr. A 2016, 1460, 51–60.
2. Agilent Technologies. Automation for LC/MS Sample Preparation: High Throughput In‑Solution Digestion and Peptide Cleanup Enabled by the Agilent AssayMAP Bravo Platform. Application note publication 5991‑2957EN.
3. Wong D. L.; Chen J. An Integrated Workflow for Peptide Mapping of Monoclonal Antibodies. Agilent Technologies application note 5991‑7811EN, 2017.
4. National Center for Advancing Translational Sciences. Pembrolizumab amino acid sequence. (GSRS/GINAS databáze, přístup 2026‑08‑14).
5. Alhazmi H. A.; Albratty M. Analytical Techniques for the Characterization and Quantification of Monoclonal Antibodies. Pharmaceuticals 2023, 16(2), 291.
6. BenchChem. A Deep Dive into Pembrolizumab: A Structural and Functional Comparison. 2026.
7. Patnaik A.; et al. Phase I Study of Pembrolizumab (MK‑3475) in Patients with Advanced Solid Tumors. Clin. Cancer Res. 2015, 21(19), 4286–4293.