Rapidly Distinguish Protein from Non-Protein Particles in Biologic Formulations

Význam tématu

Analýza subviditelných částic o velikosti 1–100 μm představuje klíčový parametr kvality biologických léčiv. Subviditelné agregáty proteinového API nebo kontaminanty mohou ovlivnit stabilitu, účinnost a imunogenitu produktu, a proto regulatorní orgány doporučují včasné zavádění strategií minimalizace agregace.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace je představit fluorescenční membránovou mikroskopii (FMM) v systému Aura™ jako rychlou, vysoce průchodnou a specifičkou metodu pro rozlišení proteinových a neproteinových částic v biologických formulacích během méně než dvou hodin.

Použitá metodika a instrumentace

• Fluorescenční membránová mikroskopie (FMM) vycházející z backgrounded membrane imaging (BMI) v systému Aura™ (Waters).
• Membránové destičky 96-jamkové pro zachycení částic o velikosti od 1 μm do 5 mm.
• Fluorescenční barvení Thioflavinem T (Ex 440/40 nm, Em 500/40 nm) pro specifickou detekci proteinových agregátů.
• Software Particle Vue s Expression Engine pro analýzu obrazu, statistiku a kvantifikaci částic.

Hlavní výsledky a diskuse

• Membránové barvení vykazuje velmi rychlou kinetiku (< 1 min) díky lokalizaci částic na membráně a umožňuje nízké objemy vzorku.
• Rozlišení proteinových hIgG agregátů a neproteinových ETFE částic potvrzeno rozdílnou fluorescenční intenzitou a optickým rozptylem (SIMI).
• Experimenty s mísením vzorků ukázaly vysokou citlivost (> 90 %) detekce proteinových částic a nízkou chybovost falešných pozitiv (< 1,5 %) u neproteinových kontrol.
• Expression Engine umožnil rychlou statistickou analýzu poměru proteinových a neproteinových populací srovnatelnou s předem známými kontrolami.

Přínosy a praktické využití metody

• Analýza až 96 vzorků do 2 hodin oproti několika minutám až hodinám u konvenčních spektrálních technik (např. Raman).
• Jednoduché a modulární workflow, které eliminuje nutnost náročné segmentace a zpracování signálu.
• Vysoká specifičnost a citlivost přispívají k efektivnímu monitoringu stability, vývoji formulací a kontrole kvality biologických léčiv.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metodiky o multiplexní fluorescenční značení pro identifikaci dalších typů částic a excipientů.
• Integrace FMM do online monitorovacích systémů výroby a kontinuální kontroly kvality.
• Další automatizace a standardizace datové analýzy ve shodě s regulačními požadavky (FDA, USP).

Závěr

Fluorescenční membránová mikroskopie v systému Aura™ nabízí efektivní, specifickou a rychlou metodu pro rozlišení proteinových a neproteinových částic v biologických formulacích. Její implementace přináší významné zkrácení analýzy, zvýšení bezpečnosti a zlepšení kontroly kvality bioléků.

Reference

• FDA Guidance for Industry: Immunogenicity Assessment for Therapeutic Protein Products. 2014.
• Parenteral Drug Association: Industry Perspective on the Medical Risk of Visible Particles in Injectable Drug Products. 2014.
• Naiki H, Higuchi K, Hosokawa M, Takeda T. Fluorometric determination of amyloid fibrils in vitro using Thioflavine T. Anal. Biochem. 1989;177:244–249.
• Levine H III. Thioflavin T interaction with synthetic Alzheimer’s disease β-amyloid peptides. Protein Sci. 1993;2:404–410.
• Groenning M et al. Study of the binding of Thioflavin T to β-sheet-rich and non-β-sheet-rich cavities. J. Struct. Biol. 2007;158:358–369.
• Kiyoshi M et al. Collaborative study for analysis of subvisible particles using flow imaging and light obscuration: Japanese Biopharmaceutical Consortium. J. Pharm Sci. 2019;108(2):832–841.