Simple Analysis of Impurities in Oligonucleotide Therapeutics Using a Single Quadrupole Mass Spectrometer

Význam tématu

Oligonukleotidová terapeutika představují perspektivní třídu léčiv založených na krátkých sekvencích nukleových kyselin. Pro zajištění kvality a bezpečnosti je nezbytné spolehlivě detekovat a charakterizovat vedlejší produkty, neúplné sekvence a degradační produkty. Kombinace vysoce účinné kapalinové chromatografie s hmotnostní spektrometrií poskytuje nejen separaci, ale i přesnou informaci o molekulové hmotnosti analytů, což je klíčové pro kontrolu čistoty oligonukleotidů.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřila na ověření schopnosti systému Nexera XS inert UHPLC spojeného s jediným kvadrupólovým hmotnostním spektrometrem LCMS-2050 detekovat a identifikovat modelový 20-mer antisense oligonukleotid a tři jeho související nečistoty s různými delecemi nukleotidů. Cílem bylo potvrdit jak efektivitu separace, tak přesnost odhadů molekulových hmotností jednotlivých látek.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: Modelový 20-mer oligonukleotid (FLP) a tři nečistoty s delecí jednoho, tří a deseti nukleotidů.
Chromatografie:

• Zařízení: Nexera XS inert UHPLC
• Kolona: Shim-pack Scepter Claris C18-300 (100×2,1 mm, 1,9 µm) při 60 °C
• Mobilní fáze A: 100 mmol/L HFIP + 10 mmol/L TEA ve vodě; B: methanol
• Gradient: 10 % B → 35 % B (0–15 min) → 40 % B (20 min) → 90 % B (20,1–22 min) → návrat na 10 % B (22,1–26 min)
• Průtok: 0,3 mL/min, injekce 6 µL, detekce UV 190–400 nm

MS podmínky:

• Zařízení: LCMS-2050 single kvadrupól s DUIS ionizátorem (ESI/APCI, negative mode)
• Rozsah skenování: m/z 550–2000
• Inteface voltage: –3 kV; nebulizační plyn 3 L/min; sušící plyn 5 L/min; ohřívací plyn 7 L/min; teplota desolvatace 450 °C; DL teplota 200 °C

Hlavní výsledky a diskuse

Chromatogramy (UV 260 nm, TIC) prokázaly těsnou, ale zřetelnou separaci nečistot v pořadí n-10 (5′), n-3 (3′), n-1 (3′) a FLP. Hmotové spektra ukázala vícenásobně nabité ionty (3–11 nábojů), které byly dekonvolučně převedeny na neutrální molekulové hmotnosti. Odhadovaná MW se lišila od teoretických pouze o 1 jednotku či méně (3552 vs. 3553; 5986 vs. 5987; 6776 vs. 6776; 7169 vs. 7169), což potvrzuje vysokou přesnost systému.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rychlou, citlivou a přesnou analýzu oligonukleotidů a jejich nečistot. Jednoduché ovládání LCMS-2050 zpřístupňuje hmotnostní spektrometrii i pracovištím bez hlubší zkušenosti, přičemž systém pokrývá široké spektrum hmotnostních rozsahů relevantních pro terapeutika na bázi nukleových kyselin.

Budoucí trendy a možnosti využití

Pro detailní identifikaci a určení sekvence nečistot se doporučuje použití kvadrupólového TOF LC-MS systému spolu s pokročilým softwarem (např. LabSolutions Insight™ Biologics). Další vývoj se zaměří na integraci automatizovaných workflow a vyšší rozlišení ionizačních technik pro komplexnější profilování biologických makromolekul.

Závěr

Testovaný systém Nexera XS inert UHPLC v kombinaci s LCMS-2050 poskytuje robustní řešení pro kvantitativní i kvalitativní kontrolu oligonukleotidových terapeutik. Vysoká přesnost dekonvoluce hmotových spekter a snadná obsluha jej řadí mezi vhodné nástroje pro rutinní QA/QC i výzkum.

Reference

• Application News No.01-00656-EN, Shimadzu Corporation, 2023
• Application News No.01-00595A-EN, Shimadzu Corporation
• Application News No.01-00558-EN, Shimadzu Corporation