Novel XL-MS analysis workflows for membrane protein characterization

Význam tématu

Membránové proteiny tvoří zhruba 30 % celého proteomu a představují více než polovinu farmaceutických cílů. Jejich analýza je však náročná kvůli hydrofobní povaze a potřebě membránových mimetik pro udržení nativní struktury.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout a otestovat end-to-end workflow pro cross-linking hromadovou spektrometrii (XL-MS) membránových proteinů v různých mimetikách (detergenty a SMALPs). Studie zahrnovala porovnání různých homobifunkčních crosslinkerů (DSS, DSSO, tBuPhoX) a zavedení disulfidového mapování pomocí MAAH-FAIMS-LC-EThcD.

Použitá metodika a instrumentace

• Křížení membránových proteinů v mikronanopartikelových SMALP či v detergentních micelách (DDM/CHS, LMNG) pomocí DSS, DSSO, tBuPhoX.
• Odstranění SMALP s MgCl₂, denaturace a alkylace, digesce trypsinem nebo pepsinem.
• Disulfidové mapování: MAAH (microwave-assisted acid hydrolysis), C18 stagetipy.
• LC-MS/MS: Thermo Vanquish Neo s EASY-Spray kolonkou, gradient 6–35 % acetonitrilu, Orbitrap Ascend Tribrid se/sebe FAIMS Pro Duo.
• OBE-native MS + DMT na Thermo Q Exactive UHMR.
• Analýza dat: Proteome Discoverer 3.2, XlinkX 3.2, SEQUEST HT, vizualizace v XMASS, XMAS v ChimeraX a PyMOL.

Hlavní výsledky a diskuse

• In-solution digesce dosáhla vyššího sekvenčního pokrytí (>90 %) a více identifikací crosslinkovaných peptidů než in-gel workflow.
• DSS poskytl více celkových křížových vazeb, tBuPhoX zvýraznil oblasti v blízkosti membrány a dimerizační rozhraní.
• MAAH-FAIMS-LC-EThcD workflow umožnil mapování disulfidových vazeb u GPCR AT2R bez výměny pufru a dosáhl vysokého pokrytí (>80 %).
• Analýza hSERINC3 kombinací native MS+DMT, MAAH a XL-MS potvrdila architekturu dvou α-šroubovicových svazků a odhalila flexibilitu domény H8.

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizované workflowy umožňují komplexní strukturální studium membránových proteinů v podmínkách blízkých nativním, minimalizují manipulaci s pufry a zkracují čas přípravy vzorku. Metody lze aplikovat na farmaceutický výzkum GPCR, virových proteinů a enzymatickou QA/QC v průmyslu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace XL-MS s nativními MS a kryo-EM pro víceúrovňové modelování proteinových komplexů.
• Rozšíření MAAH-FAIMS-LC-EThcD na studium dalších posttranslačních modifikací.
• Automatizace přípravy SMALP vzorků a vývoj nových crosslinkerů pro detailní mapování interakcí.

Závěr

Vyvinuté end-to-end XL-MS workflowy pro membránové proteiny poskytují vysoké sekvenční pokrytí, spolehlivé mapování křížových vazeb a disulfidů v detergentech i SMALP. In-solution digesce s FAIMS-LC-EThcD výrazně zjednodušuje analýzu citlivých membránových systémů bez potřeby výměny pufru.

Reference

1. Dodge G.J. et al. Mapping the architecture of the initiating phosphoglycosyl transferase from S. enterica O-antigen biosynthesis in a liponanoparticle. eLife 2024;12:RP91125.
2. Heissel S. et al. Fast and Accurate Disulfide Bridge Detection. Mol. Cell Proteomics MCP 2024;23(5):100759.
3. Liu W. et al. Online Buffer Exchange Enables Automated Membrane Protein Analysis by Native Mass Spectrometry. Anal Chem 2023;95(47):17212–17219.
4. Lagerwaard I.M. et al. Xlink Mapping and AnalySis (XMAS) – Smooth Integrative Modeling in ChimeraX. bioRxiv 2022;doi:10.1101/2022.04.21.489026.
5. Zhang H. et al. Structural basis for selectivity and diversity in angiotensin II receptors. Nature 2017;544(7650):327–332.
6. Leonhardt S.A. et al. Antiviral HIV-1 SERINC restriction factors disrupt virus membrane asymmetry. Nat Commun 2023;14(1):4368.