Optimized XL-MS workflows for heterobifunctional crosslinkers SDA and DizSEC

Optimalizace cross-linking hmotnostní spektrometrie pro heterobifunkční crosslinkery SDA a DizSEC

Význam tématu

Cross-linking hmotnostní spektrometrie (XL-MS) je klíčová pro objasnění trojrozměrné struktury proteinů a mapování jejich vzájemných interakcí. Heterobifunkční fotoaktivovatelné crosslinkery jako SDA a nově vyvinutý DizSEC umožňují selektivní navázání na lysinové zbytky a další aminokyseliny, avšak tradiční neštěpitelné větve ztěžují identifikaci a analýzu. Optimalizované workflow zkracuje čas analýzy, zvyšuje spolehlivost výsledků a otevírá cestu k rozsáhlým proteomickým studiím.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem bylo:

• Vyvinout a optimalizovat DDA metody (MS2, MS2‐MS3) na Orbitrap Exploris 480 a Ascend pro crosslinkery SDA, sulfo‐SDA a MS‐štěpitelný DizSEC.
• Porovnat tři crosslinkery u standardních proteinů (HSA, enoláza) z hlediska počtu crosslinků, smyček a proteinu–protein interakcí.
• Snížit falešné pozitivní nálezy pro DizSEC implementací specifičtější MS2‐MS3 strategie.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky standardních proteinů (human serum albumin, yeast enolase) byly crosslinkovány se SDA, sulfo‐SDA a DizSEC. Rozdělovač Vanquish Neo LC s PepMap Neo/RSLC C18 kolonkou použil gradient 6–50 % ACN za 60 min. Spektrometrie probíhala na Thermo Scientific Orbitrap Exploris 480 a Orbitrap Ascend; nastavení zahrnovalo masový rozsah 375–1600 m/z, rozlišení až 240 000, SCE HCD/CID a optimalizované AGC targety / injekční časy pro MS2 i MS3. Data byly zpracovány v Proteome Discoverer v3.2 (XlinkX uzel, SEQUEST) a v xiSEARCH/xiFDR, viz XMAS plug-in pro vizualizaci v ChimeraX.

Hlavní výsledky a diskuse

• Srovnání tří crosslinkerů ukázalo, že SDA a sulfo‐SDA poskytují obdobný počet crosslinků pro monomerické proteiny, zatímco u multimer se DizSEC projevuje mírně nižší účinnost.
• DizSEC generuje snadno štěpitelné urea vazby, které při optimálním kolizním napětí produkují charakteristické fragmenty pro přesnou identifikaci.
• Implementace MS2‐MS3 metody u DizSEC snížila falešné nálezy a zvýšila přesnost lokalizace crosslinků oproti standardnímu MS2.
• Vennovy diagramy, distribuce vzdáleností crosslinků a srovnání získaných CSM (cross‐spectral matches) potvrzují robustnost upravených parametrů na obou přístrojích.

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizované workflow výrazně zkracuje dobu analýzy a zvyšuje důvěryhodnost dat ve strukturální biochemii, farmaceutickém výzkumu i QA/QC laboratořích. Metoda je vhodná pro detailní studium proteomických interakcí, modelování komplexních proteinových architektur i validaci terapeutických cílů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další rozvoj MS‐štěpitelných crosslinkerů s cílenou reaktivitou pro specifické aminokyseliny.
• Integrace data‐independent acquisition (DIA) strategií pro komplexní biologické vzorky.
• Automatizované AI‐podporované softwarové nástroje pro rychlejší a přesnější interpretaci XL‐MS dat.
• Rozšíření metodiky do in vivo studií, mapování interaktomů celých buněk či tkání.

Závěr

Studie představuje ucelené a ověřené workflow pro heterobifunkční crosslinkery SDA a MS‐štěpitelný DizSEC. Optimalizované parametry LC‐MS2 a LC‐MS2‐MS3 na Orbitrap Exploris a Ascend přístrojích přinášejí robustní, reproducibilní a vysoce citlivou metodu pro strukturální analýzu proteinů v proteomickém měřítku.

Reference

1. Tanaka Y, Kohler JJ. Photoactivatable crosslinking sugars for capturing glycoprotein interactions. J Am Chem Soc. 2008;130(11):3278–3279.
2. Mendes ML et al. An integrated workflow for crosslinking mass spectrometry. Mol Syst Biol. 2019;15(9):e8994.
3. Fischer L, Rappsilber J. Quirks of Error Estimation in Cross-Linking/Mass Spectrometry. Anal Chem. 2017;89(7):3829–3833.
4. Faustino AM et al. Progress toward Proteome-Wide Photo-Cross-Linking to Enable Residue-Level Visualization of Protein Structures and Networks In Vivo. Anal Chem. 2023;95(28):10670–10685.
5. Lagerwaard IM et al. Xlink Mapping and AnalySis (XMAS)—Smooth Integrative Modeling in ChimeraX. bioRxiv. 2022.