Long-term stability and reproducibility of nano, capillary and micro-flow LC-MS separations

Význam tématu

V proteomice je klíčové dosáhnout vysoké stability a reprodukovatelnosti separací při nízkoproudé kapalinové chromatografii (nano, kapilární, mikro) spojené s hmotnostní spektrometrií. Dlouhodobá robustnost analýzy umožňuje spolehlivě srovnávat data napříč experimenty, laboratořemi či různými přístroji, což je zásadní pro objev biomarkerů, charakterizaci buněčných linií nebo kontrolu kvality v biotechnologických a farmaceutických aplikacích.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo vyhodnotit dlouhodobou stabilitu a mezi­zařízení reprodukovatelnost nano- a mikro-flow LC-MS separací s použitím přístrojů Vanquish Neo UHPLC a sloupců PepMap Neo pod realnými podmínkami provozu během několikaměsíčního měření. Studie zahrnovala srovnání šesti systémů ve třech laboratořích a dále vývoj a otestování robustní mikro-flow LC-MS metody pro vysokoprůtokový režim.

Použitá instrumentace

• Vanquish Neo UHPLC systémy (Thermo Fisher Scientific)
• EASY-Spray PepMap Neo kolony 75 μm×50 cm, 2 μm pro nanoLC
• Acclaim PepMap kolony 1 mm pro mikroLC
• Orbitrap Exploris 240 a 480 hmotnostní spektrometry (DDA režim)
• TSQ Altis triple kvadrupólový hmotnostní spektrometr (MRM režim)
• Chromeleon CDS a Proteome Discoverer software pro práci s daty

Metodika

Vzorky představovaly standardy BSA, cytochrom C a HeLa digest s PRTC peptidy. Separace probíhala přímo na kolonu s eluenty A (0,1 % kyselina mravenčí ve vodě) a B (80 % acetonitril ve vodě, 0,1 % kyselina mravenčí). Pro nano-flow byla použita rychlá linie gradientu 90 minut, pro mikro-flow 14,4minutový cyklus. Kolony byly udržovány při 50 °C a průtoky 300 nL/min (nano) respektive 100 μL/min (mikro). Pro vyhodnocení stability byly monitorovány parametry FWHM, retence, zpětný tlak a variabilita MS signálů nad několik stovek až tisícová dávkování.

Hlavní výsledky a diskuse

Long-term nanoLC-MS provoz na jedné kolóně po dobu 6 měsíců (1600 injekcí) prokázal konstantní hodnoty FWHM osmi BSA peptidů bez systematických odchylek a zásadní stabilitu zpětného tlaku (Δ < 25 bar). Mezi šesti systémy byla zjištěna retence peptidů s RSD < 0,2 %, variabilita počtu identifikovaných peptidových skupin 4,1 % a proteinových skupin 2,2 %. Vysokoprůtoková mikro-flow metoda při 760 injekcích odhalila tlakové fluktuace pod 3 bar a retenci dvanácti PRTC peptidů s RSD < 0,5 %, přičemž desítka peptidů měla RSD < 0,1 %.

Přínosy a praktické využití metody

Prokázaná robustnost a reprodukovatelnost umožňuje dlouhodobé studií proteomů bez nutnosti častých výměn kolony či kalibrací. To vede k úspoře času a nákladů v laboratořích, zvyšuje kvalitu dat pro kvantitativní aplikace a usnadňuje standardizaci protokolů v rámci multi-centerových projektů a farmaceutického výzkumu.

Budoucí trendy a možnosti využití

S rozvojem automatizace a strojového učení lze předpokládat další zlepšení optimalizace gradientních programů a predikce stabilního chování systému. Integrace online QC metrik s real-time vyhodnocením dat umožní okamžitou detekci odchylek. Miniaturizace kolón a využití nových materiálů pak slibují další zvýšení citlivosti při zachování robustnosti.

Závěr

Vanquish Neo UHPLC systémy ve spojení s PepMap Neo kolónami prokázaly výjimečnou dlouhodobou stabilitu a konzistenci výsledků v nano i mikro režimu. Studie dokazuje spolehlivost nízkoproudých UHPLC-MS metod pro rozsáhlé proteomické analýzy v náročných provozních podmínkách.

Reference

1. Bian Y., Zheng R., et al. Robust, reproducible and quantitative analysis of thousands of proteomes by micro-flow LC–MS/MS. Nat Commun 2020, 11, 157
2. Bian Y., Bayer F. P., et al. Robust Microflow LC-MS/MS for Proteome Analysis 38000 Runs and Counting. Anal Chem 2021, 93(8), 3686–3690