Long-term stability and reproducibility of nano-, capillary- and micro-flow LC-MS separations: the impact of hardware and separation column

Význam tématu

Low-flow LC–MS (nano-, kapilární a mikroprůtok) je klíčové pro hloubkovou proteomiku, identifikaci biomarkerů a kvantitativní analýzu ve farmaceutickém a biotechnologickém výzkumu. Dlouhodobá stabilita a reprodukovatelnost chromatografických separací jsou nezbytné pro srovnávání dat mezi zařízeními i mezi laboratořemi a pro získání spolehlivých výsledků v rozsáhlých studiích.

Cíle a přehled studie / článku

Studie hodnotí robustnost a konzistenci výkonu nového UHPLC systému Vanquish Neo při nanoLC a microLC separacích v režimu bottom-up proteomiky. Zkoumá dlouhodobou stabilitu kolony, variabilitu šířek píků, tlakovou stabilitu a reprodukovatelnost dat mezi šesti systémy a během 1600 injekcí až 6 měsíců provozu.

Použitá metodika a instrumentace

Pro nanoLC-UV testy byly použity kolony Thermo Scientific PepMap Neo (75 µm × 500 mm, 2 µm) na systému Vanquish Neo UHPLC s UV detektorem. Pro MS analýzy byly nasazeny Orbitrap Exploris 480 a Exploris 240 pracující v DDA režimu a TSQ Altis v režimu MRM. Metodika zahrnovala:

• Přímé injekce vzorků BSA, HeLa a PRTC standardů.
• Gradienty 90 min (nanoLC) a 14,4 min (microLC).
• Datové zpracování v Proteome Discoverer 2.5 se Sequest HT a INFERYS rescoringem; chromatografická data v Chromeleon 7.2.

Hlavní výsledky a diskuse

Výsledky pro nanoLC separaci:

• Retenční časy 8 vybraných peptidů stabilní s odchylkou RT <0,3 min během 1600 injekcí.
• FWHM pevných šířek píků bez postupného nárůstu, náhodné fluktuace připisované překryvům.
• Kolonový tlak se měnil méně než o 25 barů za 6 měsíců.

System-to-system reprodukovatelnost:

• Retenční časy RSD <0,2 % mezi šesti Vanquish Neo systémy.
• Profil HeLa proteomu: průměrně 33 000 peptidů a 4400 proteinových skupin na jedno měření.
• Variabilita 4,1 % pro peptidy a 2,2 % pro proteiny mezi šesti systémy.

MicroLC výsledky:

• 14,4min metoda pro 760 injekcí během 7,5 dne ukázala tlakovou stabilitu <3 bar.
• Retention time RSD <0,5 % pro všechny PRTC peptidy.

Přínosy a praktické využití metody

• Podpora rozsáhlých kohortových studií díky vysoké konzistenci a nízké variabilitě dat.
• Snížení času údržby a neplánovaných odstávek při rutinním provozu.
• Zjednodušení standardizace protokolů napříč laboratořemi a zařízeními.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace automatizovaných verifikačních postupů a on-line monitoringu kvality separace.
• Další zpřesnění kolónových materiálů a vývoj ultra vysokotlakých systémů pro zkrácení analýz.
• Kombinace s label-free a multiplexními strategiemi pro hlubší proteomické mapování.

Závěr

Komplexní testování potvrdilo, že Vanquish Neo UHPLC systém ve spojení s PepMap Neo kolony poskytuje vynikající dlouhodobou robustnost a reprodukovatelnost nano- a micro-flow LC-MS separací. Stabilní retenční časy, minimální tlakové výkyvy a vysoká konzistence mezi šesti systémy ukazují na připravenost technologie pro náročné proteomické aplikace.

Reference

1. Bian Y., Zheng R. et al. Robust, reproducible and quantitative analysis of thousands of proteomes by micro-flow LC–MS/MS. Nat. Commun. 2020, 11, 157.
2. Bian Y., Bayer F. P. et al. Robust Microflow LC-MS/MS for Proteome Analysis: 38000 Runs and Counting. Anal. Chem. 2021, 93(8), 3686–3690.