LC-MS: Vanquish Neo UHPLC system-to-system reproducibility ensures consistent and reliable results in nanoLC-MS proteomics

Význam tématu

NanoLC-MS proteomika představuje klíčovou metodu pro vysoce citlivou analýzu proteinových vzorků v biomedicínském výzkumu i průmyslové praxi. Dosažení vysoké intra- i inter-systémové reprodukovatelnosti je zásadní pro generování spolehlivých dat napříč více laboratořemi, umožňuje porovnání rozsáhlých datových souborů a podporuje statistickou validitu objevů biomarkerů či charakteristiky buněčných linií.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo zhodnotit denní i systém-ke-systému variabilitu nového UHPLC systému Vanquish Neo v kombinaci s Thermo Scientific Orbitrap Exploris 240 MS pro nanoLC-MS proteomiku. Testováno bylo šest identických LC systémů pomocí krátké 20min a standardní 100min metodiky na 75 µm × 50 cm EASY-Spray PepMap Neo kolóně. Hodnocena byla stabilita retenčních časů, variabilita špičkových parametrů (plocha, výška, FWHM) a počet identifikovaných peptidů a proteinů.

Použitá metodika a instrumentace

• UHPLC systémy: Thermo Scientific Vanquish Neo s Split Sampler NT a Binary Pump N.
• Kolona: Thermo Scientific EASY-Spray PepMap Neo (75 µm I.D. × 50 cm, 2 µm částice).
• Mass spektrometr: Thermo Scientific Orbitrap Exploris 240 v módu Full Scan (20 min) a data-dependent acquisiton (100 min).
• Použité metody: 20 min gradient (1→50 % B při 0,35 µL/min), 100 min gradient (1→20 % B při 0,3 µL/min), mobilní fáze A: voda+0,1 % FA, B: 80 % ACN +0,1 % FA.
• Příprava vzorků: Cytochrome C digest (1 pmol/µL), HeLa digest 200 ng/µL s PRTC (100 fmol/µL).
• Data processing: Chromeleon 7.2.10 CDS pro chromatografii, Proteome Discoverer 2.5 se SEQUEST HT a INFERYS rescore, FDR <1 %.

Hlavní výsledky a diskuse

Intra-systémová variabilita retenčních časů pro Cytochrome C digest v 20min metodě dosahovala RSD <0,2 % (cca 0,05–0,17 %). Inter-systémová odchylka RT v 20min metodě se pohybovala mezi 0,04–0,25 min, v 100min metodě pod 2 min. U PRTC peptidů byly RSD špičkových parametrů (plocha, výška, FWHM) ≤15 %, průměrná variabilita 5–12 %. Profilová analýza 200 ng HeLa digestu přinesla v průměru 3 3000 identifikovaných peptidů a 4 400 proteinových skupin, s mezisystémovou variabilitou 4,1 % u peptidů a 2,2 % u proteinů.

Přínosy a praktické využití metody

Stabilní výkon Vanquish Neo UHPLC systémů zajišťuje spolehlivé srovnání dat mezi různými laboratořemi či projekty. Metoda podporuje vysokou reprodukovatelnost retenčních časů i špičkových parametrů, což umožňuje širší aplikaci label-free kvantifikace, zvýšení throughputu a kvality dat v proteomice, QA/QC i farmaceutickém vývoji.

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalším krokem je automatizace přípravy vzorků a integrace UHPLC-MS do větších multi-omics studií. Vysoká reprodukovatelnost podpoří nasazení v klinických laboratořích pro rutinní biomarkerové analýzy, personalizovanou medicínu i farmakokinetické studie. Optimalizace kolón a gradientů může dále zvýšit citlivost a přesnost kvantifikace.

Závěr

Studie prokázala vynikající intra- i inter-systémovou reprodukovatelnost Vanquish Neo UHPLC systémů spojených s Orbitrap Exploris 240 pro nanoLC-MS proteomiku. Metoda nabízí robustnost, konzistenci a vysokou kvalitu dat, které podporují rozšíření nanoLC-MS do rutinních a velkokapacitních aplikací.