Unveiling hidden protein depths: a high-throughput plasma proteomics workflow for enhanced biomarker discovery on Orbitrap Astral MS

Význam tématu

Analýza plazmatických proteinů je klíčová pro identifikaci biomarkerů v raných stádiích onemocnění. Díky snadné dostupnosti vzorku a citlivosti LC-MS metod poskytuje hluboký pohled do nízce až středně expresovaných proteinů, což je zásadní pro převodní (translační) výzkum a vývoj diagnostických postupů.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vytvořit a porovnat řadu vysoce výkonných, rutinně automatizovaných workflow pro analýzu plazmy na Orbitrap Astral MS v režimu label-free DIA. Studie zahrnuje různé přístupy přípravy vzorku (obohacení, deplece, nenarušená plazma) a různé rychlosti analýzy (16–100 vzorků/den) s cílem maximalizovat proteomické pokrytí při zachování přesné kvantifikace.

Použitá metodika

Metodika zahrnovala:

• Přípravu vzorků: obohacení pomocí sady Seer Proteograph XT, depleci top-14 proteinů pomocí High Select Depletion Spin Columns a přímou analýzu neat plazmy.
• Digesi: trypsin/Lys-C enzymatické štěpení.
• Chromatografii: použití sloupců EASY-Spray PepMap (15 a 50 cm) pro 60, 100 a 24 SPD a IonOpticks TS (60 cm) pro 16 SPD.
• Analýzu: Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC spojený s Orbitrap Astral MS v režimu DIA.
• Vyhodnocení dat: přímý DIA přístup v Spectronaut, DIA-NN a Proteome Discoverer s CHIMERYS.

Použitá instrumentace

• Orbitrap Astral mass spectrometer (Thermo Scientific)
• Vanquish Neo UHPLC system (Thermo Scientific)
• EASY-Spray PepMap kolony (15 cm, 50 cm)
• IonOpticks TS UHPLC kolona (60 cm)
• Seer Proteograph XT Assay Kit (Seer Inc.)
• High Select Depletion Spin Columns (Thermo Scientific)
• EasyPep Mini MS Sample Prep Kit (Thermo Scientific)

Hlavní výsledky a diskuse

Workflowy dosáhly následujícího proteomického pokrytí a přesnosti (CV):

• Neat plazma (60 SPD): ~720 proteinových skupin, ~7700 peptidových skupin, CV ~6 %.
• Top-14 deplece (100 SPD): ~1100 proteinů, CV ~10 %; (60 SPD): ~1380 proteinů.
• Top-14 deplece (24 SPD): 1600–1850 proteinů.
• Proteograph XT obohacení (100 SPD): ~3900–4300 proteinů; (60 SPD): ~4900 proteinů, CV ~6 %.
• Dlouhý gradient (16 SPD) s IonOpticks kolonnou: >8000 proteinových skupin.
• Spectral library zvýšila identifikaci o dalších 300–600 proteinů.

Výsledky demonstrují, že kombinace optimalizované přípravy vzorku a vysoké citlivosti Orbitrap Astral významně rozšiřuje množství detekovaných proteinů a zajišťuje vysokou reprodukovatelnost.

Přínosy a praktické využití metody

• Široké proteomické pokrytí umožňuje objevit nízkoabundantní biomarkery.
• Flexibilní volba throughputu (16–100 SPD) umožňuje přizpůsobit workflow potřebám malých i velkých studií.
• Vysoká přesnost kvantifikace (CV 4–10 %) podporuje srovnatelné výsledky mezi laboratořemi.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další zvyšování rychlosti analýz při zachování hloubky pokrytí díky pokročilým separačním materiálům a algoritmům strojového učení pro analýzu DIA dat. Integrace plně automatizovaných robotických systémů a rozvoj kyber-fyzikálních laboratoří umožní masivní kohortní studie a personalizovanou medicínu.

Závěr

Vyvinuté workflowy na Orbitrap Astral MS nabízejí bezprecedentní hloubku plazmatického proteomu s vysokou přesností a variabilitou throughputu. Kombinace obohacení, deplece i nenarušené analýzy poskytuje flexibilní a efektivní přístup pro biomarkerové studie.

Reference

Yang K. et al. Unveiling hidden protein depths: a high-throughput plasma proteomics workflow for enhanced biomarker discovery on Orbitrap Astral MS. Thermo Fisher Scientific, 2024. PO147-2024-EN.