Investigating cellular metabolism on Orbitrap Excidion Pro mass spectrometer by the simultaneous use of differently labeled elemental isotope substrates

Význam tématu

Studium buněčného metabolismu pomocí stabilně značených izotopů (fluxomika) poskytuje klíčové informace o propojení metabolických drah a kinetice metabolitů. Vysoká přesnost hmotnostního analyzátoru umožňuje rozlišení jemných izotopových vzorců a odhaluje změny v metabolismu buněk za různých fyziologických podmínek.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo ověřit schopnosti hmotnostního spektrometru Orbitrap Excedion Pro v stabilně izotopových experimentech. Pomocí buněčné linie Panc02 pěstované v normoxii a hypoxii byly testovány jednotlivé a kombinované nukleární značky (13C6 glukóza, 15N2 glutamin) pro analýzu metabolických změn.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika zahrnovala extrakci metabolitů z buněk methanol-sonikací a následné rozpuštění ve 50% acetonitrilu. Chromatografické rozdělení proběhlo na Mixed Mode HILIC-AEX kolóně v systému Thermo Scientific Vanquish Horizon UHPLC. Detekce se uskutečnila na Orbitrap Excedion Pro MS při rozlišení až 240 000, což zajišťuje minimalizaci in-srce fragmentace a vysokou přesnost měření (<1 ppm). Analýza dat byla provedena v softwaru Thermo Scientific Compound Discoverer 3.4.

Hlavní výsledky a diskuse

Studie poukázala na přímou souvislost mezi vysokým rozlišením a přesností měření a schopností určit jemné izotopové vzorce ATP a dalších klíčových metabolitů. Software automaticky detekoval izotopologové vzorce a ukázal významně nižší inkorporaci 13C do prolinu v hypoxii oproti normoxii, což odráží změnu metabolické aktivity buněk.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost hlubokého profilování metabolitů v komplexních vzorcích
• Spolehlivá kvantifikace izotopologů v cílených i necílených přístupech
• Vysoká hmotnostní přesnost zvyšuje jistotu při určování sumárních vzorců
• Aplikace v biomedicínském výzkumu hypoxie a nádorové metaboliky

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávají se pokroky v automatizované analýze dat za pomoci umělé inteligence, rozšíření metodiky na multiomické studie a klinické vzorky a vývoj nových chromatografických fází pro ještě vyšší rozlišení metabolitů.

Závěr

Orbitrap Excedion Pro MS ve spojení se softwarem Compound Discoverer 3.4 prokázal svou výjimečnou citlivost, rozlišení a přesnost pro studium stabilně izotopových metabolomických experimentů. Metoda umožňuje detailní sledování změn v buněčném metabolismu pod různými podmínkami kyslíku.

Reference

Žádné