Carbon and Nitrogen Positional Isotopomer Determination in Metabolites using Orbitrap IQ-X and Stellar MS - a novel hybrid nominal mass instrument

Význam tématu

Identifikace polohových izotopomerů poskytuje klíčové informace o průtoku uhlíku a dusíku v buňkách. Díky stabilním izotopům lze objasnit, jak se metabolické cesty mění v závislosti na podmínkách, například při hypoxii. Taková data pomáhají porozumět změnám v energetickém a biosyntetickém metabolismu, což je zásadní pro výzkum onemocnění spojených s poruchou dodávky kyslíku.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo vyvinout cílený MS2/MS3 přístup pro určení pozice izotopových nábojů v adenozinmonofosfátu (AMP). Metoda kombinuje vysokorozlišovací Orbitrap IQ-X s hybrydním Stellar MS, aby bylo možné získat strukturové informace i na nominal mass přístrojích. Aplikace byla demonstrována na in vitro modelu hypoxie lidských pankreatických KP4 buněk.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Vanquish Horizon UHPLC se separací na HILIC kolonce
• Orbitrap IQ-X Tribrid mass spectrometer (HRAM)
• Stellar MS (hybridní kvadrupól-iontová past)

Použitá metodika

Vzorky byly připraveny z E. coli extractů (U-13C a 12C) pro structurální anotaci a z KP4 buněk pěstovaných v normoxii (21 % O₂) a hypoxii (0,5 % O₂). Mediální složení zahrnovalo:

• neoznačené živné médium
• 13C6-glukózu
• 15N2-glutamin
• kombinaci 13C6-glukózy a 15N2-glutaminu

Separační metoda: HILIC-UHPLC. Analýza: sken MS1 následovaný cíleným HCD a CID MS2 a MS3 fragmentací. Data byly zpracovány v Mass Frontier 8.1 (strukturní anotace) a TraceFinder 5.2 (kvantifikace PRM).

Hlavní výsledky a diskuse

• Metoda umožnila rozlišení polohových izotopomerů AMP, včetně atomů dusíku z aspartátu, glutaminu a glycinu.
• Při hypoxii dochází k nárůstu glukózového příjmu, anaerobní glykolýzy a laktátové exkrece se současným poklesem oxidačního metabolismu.
• U AMP-M+9 izotopomeru byla prokázána vyšší redukce pod hypoxií ve srovnání s normoxií.
• Fragmentace MS3 odhalila, že dusík glycinu v adeninu zůstává neoznačený, což potvrzuje specifické zdroje dusíku v různých částech molekuly.

Přínosy a praktické využití metody

Vyvinutý MS2/MS3 workflow poskytuje robustní nástroj pro detailní tokovou analýzu (fluxomics) i na nominal mass přístrojích. Umožňuje:

• přesnou kvantifikaci polohových izotopomerů
• strukturní anotaci metabolitů
• monitorování buněčných adaptačních mechanismů při hypoxii

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodu lze rozšířit na další metabolity důležité v onkologii, neurobiologii či farmakometabolomice. Perspektivní je integrace s vysoce propustnými systémy, automatizovaná analýza dat a kombinace s dalšími rozlišovacími principy (ion mobility).

Závěr

Studie představila úspěšný postup pro stanovení polohových izotopomerů AMP pomocí Orbitrap IQ-X a Stellar MS. Ukázala praktickou aplikaci na hypoxický model a zdůraznila možnosti nominal mass přístrojů v pokročilém fluxomics výzkumu.

Reference

• Deshpande R.R., Midha A., Amer B., Moehring T., Jain I., Jacob C.C., Bird S. Carbon and Nitrogen Positional Isotopomer Determination in Metabolites using Orbitrap IQ-X and Stellar MS – a novel hybrid nominal mass instrument. Thermo Fisher Scientific, 2024.