Detecting Stable Isotope Labeled Metabolites in Untargeted Analysis Using a Benchtop Orbitrap Mass Spectrometer and a Single Processing Software Platform

Význam tématu

Stabilní izotopové značení (SIL) v netargetované metabolomice představuje klíčový nástroj pro sledování metabolických drah a přesné určování vzorců neznámých sloučenin. Integrace získávání a zpracování dat v jednom experimentu zvyšuje efektivitu a kvalitu analýzy.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout jednotný workflow pro detekci 13C značených metabolitů v netargetované analýze s použitím benchtop Orbitrap Exploris 240 a jediného softwarového prostředí. Experiment zahrnoval směsi E. coli extraktů s různými úrovněmi 13C inkorporace (0, 10, 25, 50, 100 %) v rámci jednoho běhu.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: suché E. coli extrakty rehydratované ve vodě s 0,1 % kyseliny mravenčí, kombinace různých poměrů značených a neznačených extraktů.

• LC: Thermo Scientific Vanquish UHPLC s Hypersil GOLD kolonkou (1,9 μm, 150 × 2,1 mm), gradient 0,1 % FA ve vodě/ACN, tok 300 μL/min, teplota 45 °C.
• MS: Orbitrap Exploris 240, pozitivní režim, rozlišení 30K, 60K, 120K, pásmo m/z 67–1000, interní kalibrace Easy-IC, S-lens 70 % RF.
• Fragmentace: AcquireX inteligentní akvizice a HCD s energií 30/50/150 %.
• Software: Thermo Scientific Compound Discoverer pro netargetované zpracování SIL, neznámá anotace (ChemSpider, mzCloud) a mapování drah.

Hlavní výsledky a diskuse

Vysoce přesné měření (≤1 ppm) a rozlišení umožnilo spolehlivé určení elementárních složení (např. adenosin [M+H]+ m/z 268,10385, C10H13N5O4). Detekce isotopologů uracilu a tryptofanu potvrdila očekávané poměry inkorporace s nízkými %CV. Netargetovaný přístup odhalil nečekané metabolity (cytosin, uracil) v pyrimidinové záchytné dráze s překrytými hladinami inkorporace.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Komplexní profilování metabolitů bez předběžné volby cílových látek.
• Spolehlivou kvantifikaci izotopologů při definovaných poměrech inkorporace.
• Schopnost detekce a anotace neočekávaných sloučenin.
• Zrychlené zpracování dat v jedné softwarové platformě.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje:

• Rozšíření značení na další izotopy (15N, 18O) a vícenásobné značení pro komplexní trasování.
• Využití strojového učení pro automatizovanou anotaci a detekci vzorců.
• High-throughput aplikace v klinické a průmyslové analýze.
• Integrace metabolomických dat s genomikou a proteomikou pro systémovou biologii.

Závěr

Propojení netargetované metabolomiky se SIL v jediném experimentu a softwaru výrazně zlepšuje citlivost, spolehlivost a flexibilitu analýzy. Tím se otevírá širší využití ve výzkumu metabolických drah, kvantitativní fluxové analýze a objevování nových biomarkerů.