Sensitive Quantitation of Glucagon-Like Peptide-1 (GLP-1) Analog Tirzepatide in Plasma

Význam tématu

Analýza GLP-1 receptor agonistů je klíčová pro vývoj léků na obezitu a diabetes 2. typu.
Citlivé stanovení koncentrace těchto peptidů v plasmatických vzorcích umožňuje přesné farmakokinetické a toxikokinetické studie, zrychlení vývoje léčiv a snížení nákladů spojených s přípravou protilátek a reagens.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo navrhnout zcela automatizovaný LC/MS workflow pro kvantifikaci GLP-1 analogů, konkrétně tirzepatidu, v lidské plazmě bez nutnosti specifických protilátek.
Testovaný postup využívá Agilent 1290 Infinity II bio LC ve spojení s Agilent 6495D triple kvadrupólovým LC/TQ systémem a dosahuje dolní mez kvantifikace 0,05 ng/mL při objemu vzorku 100 µL a lineární rozsah až do 1 000 ng/mL.

Použitá instrumentace

• Agilent AssayMAP Bravo protein sample prep platform (G5571AA)
• Agilent 1290 Infinity II bio UHPLC: vysokotlaké čerpadlo (G7132A), multisampler (G7137A) a termostat kolony (G7116A + G7116-60071)
• Agilent 6495D triple kvadrupólový LC/MS (G6495DA) s elektrospray ionizací Jet Stream
• Agilent AdvanceBio Peptide Mapping kolona (2,1 × 150 mm, 120 Å, 2,7 µm)
• Software Agilent MassHunter Acquisition a Quantitative Analysis verze 12.0

Použitá metodika

Vzorky lidské plazmy byly obohaceny o tirzepatid a semaglutid jako interní standard, poté byly proteiny sráženy směsí ACN:MeOH (1:1).
Po odpaření supernatantu a rehydrataci proběhla automatizovaná purifikace na AssayMAP RP-S kazetách s optimalizací podmínek načítání, praní a elučního pufru (5 % FA v 80 % ACN).
Chromatografické rozlišení je dosaženo gradientem fází voda + 0,1 % FA a ACN + 0,1 % FA při 0,4 mL/min a 80 °C kolony.
MS detekce probíhá v MRM režimu se zvolenými přechody 1 204,4 > 396,2 pro tirzepatid (kvantifikátor) a doplňujícím 1 204,4 > 299,2; interní standard semaglutid je sledován při 1 029,4 > 1 238,1.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace extrakčního rozpouštědla pro srážení proteinů ukázala ACN:MeOH (1:1) jako nejlepší volbu.
Nejvhodnější načítací pufr byl čistá voda, praní proběhlo v 10 mM ammonium formiátu pH 10 s 10 % ACN a eluční pufr 5 % formiové kyseliny v 80 % ACN.
Workflow dosáhlo LLOQ 0,05 ng/mL a lineárního rozsahu 0,05–1 000 ng/mL s koeficientem lineárního regresního modelu R2 ≥ 0,996.
Inter- a intradení přesnost a přesnost se pohybovaly v rozmezí ±15 % a CV ≤ 15 % na všech úrovních QC, což splňuje požadavky regulačních norem.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizace celého vzorkopřípravného postupu výrazně zvyšuje reprodukovatelnost a propustnost laboratoře.
LC/MS přístup eliminuje potřebu časově náročné přípravy protilátek a minimalizuje riziko zkřížených reakcí.
Metoda nabízí výjimečnou citlivost, vysokou specificitu a široký dynamický rozsah vhodný pro farmakokinetické studie a QA/QC v biopharmaceutickém průmyslu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Možnosti rozšíření zahrnují aplikaci postupu na další GLP-1 analogy a velké peptidové molekuly.
Dále se uplatní integrace s vysoce výkonnými výměnnými procesy a LIMS pro plně digitální sledování vzorků.
Rozvoj HRMS technologií by mohl doplnit identifikaci metabolit a degradantů v rámci stejných workflow.

Závěr

Navržené automatizované LC/MS workflow s Agilent 1290 Infinity II bio LC a 6495D LC/TQ umožňuje citlivou, specifickou a rychlou kvantifikaci tirzepatidu v lidské plazmě.
Dosahuje LLOQ 0,05 ng/mL, lineární dynamický rozsah 0,05–1 000 ng/mL a splňuje regulační kritéria přesnosti a přesnosti.
Postup je univerzální, snadno rozšířitelný na další peptidová léčiva a významně akceleruje proces vývoje farmaceutických látek.

Reference

• DailyMed Mounjaro tirzepatid injection solution 13 May 2022
• DailyMed Zepbound tirzepatid injection solution 9 November 2023