Capsid Protein Analysis of Viral Vector- Based Gene Therapeutics by Hydrophilic Interaction Chromatography

Význam tématu

Adeno-asociované viry (AAV) představují klíčové nosiče genové terapie, avšak jejich komplexní struktura z 60 podjednotek VP1, VP2 a VP3 a vysoká podobnost sekvencí ztěžují rychlou a spolehlivou charakterizaci. Detailní analýza poměnného zastoupení těchto proteinu a jejich posttranslačních modifikací je zásadní pro kontrolu kvality a konzistentnost výrobních dávek v biotechnologickém průmyslu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo demonstrovat efektivitu hydrofobně-interakční chromatografie (HILIC) na sloupci GTxResolve Premier BEH Amide 300 Å (1,7 µm, 2,1 × 150 mm) pro separaci intaktních kapsidových proteinů AAV různých sérotypů (AAV2, AAV8) po chemickém rozpuštění (guanidin-HCl) a přípravě acetónovou precipitací. Studie porovnává dva přístupy vzorkování (acetónová precipitace vs. nástřik s guanidinem) a hodnotí variabilitu mezi výrobními šaržemi na základě počtu a intenzity PTM proteoform.

Použitá instrumentace

• Chromatografický systém: ACQUITY Premier UPLC System (Waters)
• Kolona: GTxResolve Premier BEH Amide 300 Å, 1,7 µm, 2,1 × 150 mm
• Detekce: fluorescenční detektor (excitace 280 nm, emise 348 nm) a UV detektor při 280 nm

Použitá metodika

Vzorky AAV byly připraveny dvěma způsoby: acetónovou precipitací následnou resuspendací v 6 M guanidinu-HCl versus přímým bracketovaným vstřikováním guanidinu v 50/50 vodě/ACN. Analýza probíhala při 60 °C na kolóně HILIC se solventy A: 0,1 % TFA ve vodě a B: 0,1 % TFA v acetonitrilu. Použit byl sekvenční gradient a pozice vstřiku rozpouštědla ACN před a po vzorku ke snížení efektu breakthrough.

Hlavní výsledky a diskuse

HILIC umožnil rozdělit VP3, VP2 a VP1 s následným rozlišením jejich proteoform podle PTM (oxidace, fosforylace). Acetónová precipitace výrazně zvýšila signál a rozlišení nízkointenzivních forem, zatímco bracketované vstřiky guanidinu omezily šíření pásu, ale mírně snížily rozlišení. Analýza šarží ukázala odlišné profily PTM mezi loty AAV2 (20-481 vs. 24-409) i AAV8 (24-227 vs. 24-337), evidující lot-to-lot variabilitu ve složení a modifikacích kapsidových proteinů. Kvantitativní poměry VP1:VP2:VP3 se blížily očekávaným 1:1:10, přičemž fluorescenční detekce poskytla hladší a stabilnější signál než absorbance.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlé 30minutové profilování intaktních kapsidových proteinů různých AAV sérotypů
• Citlivé odhalení post-translačních modifikací a batch-to-batch rozdílů
• Podpora vývoje a kontroly kvality genových terapií pro zajištění konzistence přípravků

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se integrace HILIC s hmotnostní spektrometrií pro podrobnější identifikaci PTM a kvantitativní analýzu, automatizace přípravy vzorků a rozvoj vysokopropustných metod pro screening velkého množství šarží. Dále lze metodu využít pro monitorování stability v průběhu shelf-life a validaci kontrolních postupů v GMP prostředí.

Závěr

Výsledky potvrzují, že HILIC na GTxResolve Premier BEH Amide kolónách je účinným nástrojem pro komplexní analýzu AAV kapsidových proteinů. Metoda umožňuje spolehlivě detekovat PTM a kvantifikovat poměry VP proteinů mezi šaržemi a sérotypy, což je klíčové pro vývoj bezpečných a účinných genových terapií.

Reference

1. Wang J.-H.; Gessler D. J.; Zhan W.; Gallagher T. L.; Gao G. Adeno-associated virus as a delivery vector for gene therapy of human diseases. Signal Transduct. Target. Ther. 2024, 9, 78.
2. Clark M. F.; Adams A. N. Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. J. Gen. Virol. 1979, 45(1), 209–213.
3. Ryan J. P.; Kostelic M. M.; Hsieh C.-C.; Powers J.; Aspinwall C.; Dodds J. N.; Schiel J. E.; Marty M. T.; Baker E. S. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2023, 34(12), 2811–2821.
4. Gimpel A. L.; Katsikis G.; Sha S.; Maloney A. J.; Hong M. S.; Nguyen T. N. T.; Wolfrum J.; Springs S. L.; Sinskey A. J.; Manalis S. R.; Barone P. W.; Braatz R. D. Analytical methods for process and product characterization of recombinant adeno-associated virus-based gene therapies. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2021, 21, 237–251.
5. Liu A. P.; Patel S. K.; Xing T.; Yan Y.; Wang S.; Li N. Characterization of adeno-associated virus capsid proteins using hydrophilic interaction chromatography coupled with mass spectrometry. J. Pharm. Biomed. Anal. 2020, 189, 113481.
6. Fekete S.; Imiolek M.; Lauber M. Advantages of sequential or bracketed injection methods to improve the chromatographic analysis of biotherapeutics. LCGC International 2024, 20, 17–24.
7. Chapel S.; Rouvière F.; Peppermans V.; Desmet G.; Heinisch S. A comprehensive study on the phenomenon of total breakthrough in liquid chromatography. J. Chromatogr. A 2021, 1653, 462399.
8. Chapel S.; Rouvière F.; Heinisch S. Comparison of existing strategies for keeping symmetrical peaks in on-line hydrophilic interaction liquid chromatography × reversed-phase liquid chromatography despite solvent strength mismatch. J. Chromatogr. A 2021, 1642, 462001.
9. Beaumal C.; Guapo F.; Smith J.; Carillo S.; Bones J. Combination of hydrophilic interaction liquid chromatography and top-down mass spectrometry for characterisation of adeno-associated virus capsid proteins. Anal. Bioanal. Chem. 2025, 417(10), 2345–2358.