Assessing key attributes of adeno-associated viral proteins using UHPLC-FLD-intact accurate mass analysis

Význam tématu

Rekombinantní adeno-asociované viry (rAAV) jsou klíčovým nástrojem genové terapie díky vysoké účinnosti přenosu genů a výbornému bezpečnostnímu profilu. Kvalita AAV produktů závisí na složení a modifikacích kapsidových proteinů VP1, VP2 a VP3. Precizní charakterizace jejich poměrů a posttranslačních modifikací (PTM) je nezbytná pro zajištění konzistence, bezpečnosti a účinnosti léčiv.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout rychlou a citlivou UHPLC-FLD-HRAM MS metodu pro souběžné stanovení poměrů kapsidových proteinů VP1, VP2, VP3 a jejich proteoform, včetně truncovaných variant, u různých serotypů AAV. Studie ověřila schopnost metody sledovat klíčové atributy napříč šaržemi a výrobními procesy.

Použitá instrumentace

• UHPLC systém Vanquish Horizon se C4 kolonkou (1,0 × 100 mm, 300 Å, 1,7 μm)
• Fluorescenční detektor Vanquish Fluorescence Detector F
• Orbitrap Exploris MX mass spectrometr s BioPharma Option
• Software Thermo Scientific BioPharma Finder 5.0

Použitá metodika

Vzorky AAV sér 1, 6, 8 a 9 byly upraveny výměnou pufru do 80 % vody/20 % acetonitrilu s 5 mM TCEP a 0,1 % formiátové kyseliny. Chromatografie probíhala při 80 °C a průtoku 80 μl/min na gradientu rozpouštědel A (voda s 0,1 % difluorooctové kyseliny) a B (acetonitril s 0,1 % difluoroctové kyseliny). Fluorescenční detekce využívala optimální excitační a emisní vlnové délky pro kapsidové proteiny. MS analýza v režimu ESI byla nastavena na vysoké rozlišení a cílovou hodnotu AGC zajišťující hromadění dostatečného počtu iontů pro přesné stanovení intact mass s mass accuracy < 10 ppm.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila efektivní separaci a kvantifikaci VP1, VP2 a VP3 pomocí integrovaných FLD signálů. Orbitrap Exploris MX poskytl vysoce kvalitní spektra pro hlavní proteiny i méně hojná truncovaná a modifikovaná proteoformy. U interně připravených AAV9 vzorků byl poměr VP1:VP3 a VP2:VP3 vyšší než u komerčního produktu, i když průměrné hmotnosti truncovaných forem se shodovaly. Byly identifikovány deamidace, fosforylace a acetylace VK proteoform v rámci jednotlivých sérií a serotypů, což dokládá schopnost metody rychle odlišit a potvrdit serotyp a stav PTM.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlé sledování kritických kvality atributů AAV produktů v režimu vysokého throughputu
• Spolehlivé stanovení poměru VP1, VP2 a VP3 napříč šaržemi i výrobními procesy
• Ověření identity serotypu a potvrzení posttranslačních modifikací s vysokou přesností
• Aplikace ve výzkumu, vývoji a kvalitativní kontrole v biotechnologickém a farmaceutickém průmyslu

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metody na další virové vektory a různé formy genových léčiv
• Automatizace přípravy vzorků a integrace do online QC systémů ve výrobě
• Prohloubená charakterizace PTM využitím vyššího rozlišení a komplementárních detektů
• Využití strojového učení pro predikci stability a účinnosti na základě proteoform profilu

Závěr

Popsaná UHPLC-FLD-HRAM Orbitrap MS metoda představuje robustní a rychlý nástroj pro detailní analýzu AAV kapsidových proteinů a jejich modifikací. Vysoká citlivost, rozlišení a přesnost intact mass umožňují spolehlivou kontrolu kvality, potvrzení serotypu a sledování posttranslačních modifikací v rámci vývoje a výrobních procesů genových terapií.

Reference

Kiyonami R, Gamez R, Du M, Thompson K, Liu CY, Kraegenbring J, Crone C. Assessing key attributes of adeno-associated viral proteins using UHPLC-FLD-intact accurate mass analysis. Thermo Fisher Scientific Application Note PO66151-EN0422S; 2022.