Slalom-Aided Anion Exchange Chromatography for Enhanced Analysis of Plasmid DNA Topological Impurities

Význam tématu

Analýza topologických forem plasmidové DNA je klíčová pro vývoj a kontrolu kvality genové terapie a biologických léčiv. Různé konformace (superšroubovice, otevřená kružnice, lineární) ovlivňují transfeční účinnost, biologickou aktivitu a regulační schvalování přípravků.

Cíle a přehled studie / článku

Studie představuje kombinaci tradiční aniontové výměnné chromatografie (AEX) a fenoménu slalomové chromatografie ke zvýšení selektivity při rozlišení topologických izomerů plasmidové DNA. Testovány byly tři modelové konstrukty (pBR322, ΦX174 RF I/II, pCMV‐Cas9) o velikosti 4,4–7,0 kbp.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separace byl použit systém Waters ACQUITY Premier s binárním rozpuštědlovým manažerem, průtokovým jehlovým autosamplerem a PDA detektorem eLambda s titanovou tokovou cely (5 mm). Separace probíhala na kolóně Protein-Pak Hi Res Q (4,6 × 100 mm, 5 µm) při 35 °C. Mobilní fáze A byla 20 mM Tris, 5 % urea, pH 9,0, fáze B byla shodná s navýšenou koncentrací NaCl (1,0 M). Gradient NaCl (0,6–1,0 M) byl aplikován při různých průtocích (0,1–0,8 mL/min). Odběry dat probíhaly při 260 nm.

Hlavní výsledky a diskuse

Bylo prokázáno, že zvýšením průtoku roste retence lineární DNA relativně ke konformacím s omezenou elasticitou. Pro pBR322 byla optimální selektivita na 0,8 mL/min, pro ΦX174 RF I/II na 0,8 mL/min a pro plasmid Cas9 na 0,3 mL/min. Tato dual‐mode mechanismus kombinuje elektrostatickou retenci AEX a hydrodynamické (slalomové) efekty, což umožňuje systémové rozlišení všech tří izomerů na jednom gradientním metodickém nastavení.

Přínosy a praktické využití metody

• Úplná baseline separace superšroubovice, otevřené kružnice a lineární DNA včetně biologicky významných plasmidů
• Jednoduchá optimalizace selektivity pouze úpravou průtoku bez změn složení mobilní fáze
• Vysoká opakovatelnost a škálovatelnost vhodné pro QC genových terapií

Budoucí trendy a možnosti využití

• Vývoj kolón a slalomových stacionárních fází pro vyšší tlaky a širší rozsah velikostí DNA/RNA
• Integrace ultravysoce výkonné slalomové chromatografie pro rychlé profilování biopolymérů
• Komplexní workflow kombinující AEX–slalom s dalšími detekčními metodami (MS, multiwavelength PDA)
• High-throughput screening nových topologických variant a optimalizace průmyslových výrobních procesů

Závěr

Kombinace AEX a slalomové chromatografie na kolóně Protein-Pak Hi Res Q umožňuje robustní a univerzální rozlišení tří hlavních topologických forem plasmidové DNA bez nutnosti komplikovaných úprav mobilní fáze. Metoda nabízí efektivní nástroj pro kontrolu kvality a analýzu genové terapie.

Reference

• 1. Piao X. et al. Supercoiled DNA Percentage: A Key In-Process Control… Mol Ther Nucleic Acids, 2024.
• 2. Huber C. G. Micropellicular Stationary Phases for High-Performance Liquid Chromatography of Double-Stranded DNA. J Chromatogr A, 1998.
• 3. Strege M. A., Lagu A. L. Anion-Exchange Chromatography of DNA Restriction Fragments. J Chromatogr A, 1991.
• 4. Smith C. R. et al. Separation of Topological Forms of Plasmid DNA by Anion-Exchange HPLC. J Chromatogr B, 2007.
• 5. Pavlin N. et al. Analytical Separation of Plasmid DNA Isoforms Using Anion Exchanging Chromatographic Monoliths. Electrophoresis, 2023.
• 6. Yang H., Koza S., Chen W. Plasmid Isoform Separation and Quantification by Anion-Exchange Chromatography (AEX). Waters Application Note, 2021.
• 7. Hirabayashi J., Kasai K. ichi. Effects of DNA Topology, Temperature and Solvent Viscosity on DNA Retardation in Slalom Chromatography. J Chromatogr A, 2000.
• 8. Gritti F. Retention Mechanism in Slalom Chromatography: Perspectives on… J Chromatogr A, 2025.
• 9. Gritti F. Ultra-High Pressure Slalom Chromatography… J Chromatogr A, 2024.
• 10. Finny A. S. et al. High-Resolution Size Exclusion Chromatography of Megadalton-Sized DNA Vectors… Waters Application Note, 2025.