Plasmid Isoform Separation and Quantification by Anion-Exchange Chromatography (AEX)

Význam tématu

Separační analýza forem plasmidové DNA je klíčová pro vývoj genové terapie a vakcín.
Superstočená forma je z biopotency zcela zásadní, zatímco otevřená cirkulární a lineární formy patří mezi nečistoty s možným negativním vlivem na účinnost a bezpečnost produktů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikačního popisu je demonstrovat použití aniontově výměnné chromatografie na systému ACQUITY UPLC H-Class Bio ve spojení se sloupcem Protein-Pak Hi Res Q pro separaci a kvantifikaci tří hlavních isoform plasmidu ΦX174.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda vychází z aniontově výměnné chromatografie, která rozlišuje jednotlivé formy plasmidu podle rozdílů v lokální hustotě záporného náboje.
Aniontová chromatografie se ukazuje jako robustní, reprodukovatelná a snadno automatizovatelná technika s nízkou spotřebou vzorku.

• LC systém ACQUITY UPLC H-Class Bio
• Detektor UPLC TUV při 260 nm
• Kolona Protein-Pak Hi Res Q 4.6 x 100 mm 5 µm
• Mobilní fáze Tris pH 7,4 a tetramethylamoniumchlorid s gradientem od 1,69 M do 1,75 M
• Teplota kolony 30 °C teplota vzorku 10 °C
• Průtok 0,4 mL/min objem injekce 0,6–10 µL

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila jasné rozlišení superstočené otevřené cirkulární a lineární formy plasmidu ΦX174 podle retenční doby.
Optimalizace pH a teploty ukázala, že pH 7,4 a 30 °C poskytují nejlepší rozlišení mezi otevřenou cirkulární a lineární formou.
Kvantitativní linearita vztažená k množství vzorku byla pro všechny tři isoformy v rozsahu 117 ng až 1875 ng vynikající, bez selektivních ztrát jednotlivých forem.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká reprodukovatelnost a robustnost analýzy
• Nízká spotřeba vzorku a snadná automatizace
• Alternativa k agarózové elektroforéze a kapilární elektroforéze s vyšší propustností a přesností kvantifikace
• Vhodné pro pravidelné testování čistoty superstočené formy plasmidu podle průmyslových norem

Budoucí trendy a možnosti využití

Využití AEX pro přímou analýzu plasmidů v lysátech bez předchozí čistící stopy
Rozšíření metody na větší plasmidy a různé konstrukty
Možné propojení s hmotnostní spektrometrií nebo dalšími detektory pro komplexní charakterizaci plasmidů

Závěr

Aniontově výměnná chromatografie na systému ACQUITY UPLC H-Class Bio se sloupcem Protein-Pak Hi Res Q je efektivní analytickou metodou pro separaci a kvantifikaci biologicky relevantních forem plasmidové DNA.
Metoda splňuje požadavky na robustnost linearitu a přesnost při nízkých nárocích na spotřebu vzorku.

Reference

1. Abdulrahman A a Ghanem A Recent Advances in Chromatographic Purification of Plasmid DNA for Gene Therapy and DNA Vaccines A Review Analytica Chimica Acta 2018 1025 41–57
2. Hitchcock AG a kol Scale Up of a Plasmid DNA Purification Process BioProcess International 2010 8(11) 46–54
3. CBER Guidance for Industry Considerations for Plasmid DNA Vaccines for Infectious Disease Modifications US FDA 2007
4. Molloy MJ a kol Effective and Robust Plasmid Topology Analysis and the Subsequent Characterization of the Plasmid Isoforms Thereby Observed Nucleic Acids Research 2004 32(16) e129
5. Smith CR a kol Separation of Topological Forms of Plasmid DNA by Anion Exchange HPLC J Chromatogr B 2007 854 121–127