Benchmarking diagonal-PASEF data acquisition for high-throughput proteomics applications

Význam tématu

Proteomika v režimu vysoké propustnosti vyžaduje metody, které dokážou rychle a spolehlivě identifikovat a kvantifikovat velké množství proteinů i při velmi nízkých vzorkových dávkách. Kombinace datově nezávislé akvizice a iontové mobility přináší další dimenzi separace a výrazně zvyšuje schopnost rozlišit a detekovat vzácné signály v komplexních biologických směsích. Diagonal-PASEF představuje inovativní přístup, který optimalizuje výběr iontů podle skutečného tvaru jejich distribuce a může významně zvýšit počet identifikovaných proteinů i kvantitativní přesnost měření.

Cíle a přehled studie

Cílem této práce bylo porovnat klasický dia-PASEF s několika variantami diagonal-PASEF metod obsahujícími různý počet průřezů (1, 2, 4, 8 nebo 12) a optimalizovat je pro vysokoprůchodovou analýzu proteomů lidských buněk. Autoři stanovili výkonové parametry jako počet identifikovaných peptidů a proteinů, cyklus akvizice, odezvu při nízkých dávkách vzorku a kvantitativní reprodukovatelnost.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci peptidů byla použita nanoHPLC na sloupci 25 cm × 0,075 mm s nelineárním gradientem během 17 minut při průtoku 300 nl/min. Analýzy probíhaly na spektrometru timsTOF HT (Bruker). Data se zpracovávala v softwaru Spectronaut verze 19.8 s directDIA workflow. U diagonal-PASEF metod se aplikoval režim Legacy pro předzpracování a redukce vzorkování mobility i retenčního času odpovídající počtu řezů.

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnání prokázalo, že diagonal-PASEF metody se 1 až 4 řezy poskytují při nízkém zatížení (5–100 ng HeLa digestu) až o 25–36 % více identifikovaných peptidů a o 6–16 % více proteinových skupin než dia-PASEF se statickými nebo variabilními okny. Při vyšších dávkách (100–1000 ng) vede zvyšující se počet řezů k dalšímu nárůstu identifikací, přičemž metoda s 12 řezy přináší až o 18 % více proteinových skupin při 100 ng a o 7 % více při 1000 ng ve srovnání s kontrolou. Kvantitativní přesnost všech diagonal-PASEF variant byla nadstandardně vysoká a cv<20 % bylo dosaženo u 56–77 % peptidů v závislosti na počtu řezů.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšení počtu identifikací a proteinových skupin při nízkých i vysokých dávkách.
• Vysoká kvantitativní přesnost vhodná pro reprodukční analýzy.
• Rychlé cykly akvizice vhodné pro vysokoprůchodové aplikace.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s pokročilými algoritmy strojového učení pro ještě přesnější dekonvoluci signálů.
• Adaptace na jiné typy spektrometrů a širší škálu biologických vzorků.
• Rozšíření do klinické proteomiky pro diagnostiku a personalizovanou medicínu.

Závěr

Diagonal-PASEF akviziční režimy výrazně zlepšují počet identifikovaných peptidů a proteinových skupin i kvantitativní reprodukovatelnost oproti standardní dia-PASEF. Rozdílný počet řezů umožňuje přizpůsobit metodu specifickým potřebám dávkování vzorku a cílené aplikace, což otevírá cestu k efektivnímu vysokoprůchodovému proteomickému workflow.

Reference

Below C et al Benchmarking diagonal-PASEF data acquisition for high-throughput proteomics applications Anal Chem 2025