Biophysical Characterization of Enveloped VLPs Using a Waters GTxResolve™ 2000 Å SEC Column, MaxPeak™ Premier 3 μm

Význam tématu

Virus-like částice (VLP) s obálkou (eVLP) představují perspektivní nosiče pro léčebné a diagnostické aplikace díky schopnosti napodobit virus bez infekčnosti. Jejich membránou vázané antigeny zvyšují imunogenicitu a dovolují cílenou distribuci léčiva či nukleových kyselin. Pro zajištění kvality, stability a bezpečnosti terapeutik založených na eVLP je klíčové jejich důkladné biophysikální charakterizování.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a optimalizovat analytickou metodu pro analýzu eVLP pomocí velikostně vylučovací chromatografie (SEC) spojené s multiúhlovým rozptylem světla (MALS) a hromadnou dynamickou rozptylovou spektroskopií (DLS). Klíčové kroky zahrnovaly výběr pórovitosti a chemie SEC kolony, optimalizaci mobilní fáze a simultánní měření velikosti i koncentrace eVLP.

Použitá metodika a instrumentace

Postup zahrnoval:

• Optimalizaci mobilní fáze (20 mM fosfátový pufr, 276 mM NaCl/KCl, 0,006 % PS80, 25 % sacharózy, pH 7,4).
• Batch DLS měření hydrodynamického poloměru a koncentrace částic.
• SEC-MALS analýzu na kolonech GTxResolve 2000 Å, MaxPeak Premier 3 µm (4,6×150 mm a 7,8×150 mm).
• Simultánní detekci UV (220 nm, 280 nm), dRI a světelný rozptyl (MALS + QELS).

Použitá instrumentace

• ACQUITY Arc Premier System s Quaternary Solvent Manager a Flow Through Needle Sample Manager
• Kolony GTxResolve 2000 Å SEC Column, MaxPeak Premier 3 µm (4,6×150 mm, 7,8×150 mm)
• ACQUITY 2489 TUV UV/Vis detektor
• Wyatt Technology DAWN MALS detektor se zabudovaným QELS modulem
• Wyatt Optilab dRI detektor
• DynaPro NanoStar pro DLS
• Empower Chromatography Data System a ASTRA 8.3 software

Hlavní výsledky a diskuse

Během optimalizace mobilní fáze bylo zjištěno, že pro maximální návratnost eVLP je nezbytná iontová síla ≥300 mM NaCl/KCl. Přidání 0,006 % PS80 a 25 % sacharózy dále zlepšilo signál. DLS ukázalo homogenní populaci s průměrným Rh = 59,9 nm a nízkou polydisperzitou (PDI = 0,10). SEC-MALS potvrdilo monodisperzní vrchol s geometri ckým poloměrem Rz ≈ 61 nm a malou špičkou odpovídající dvojicím či vyšším agregátům (78–88 nm). Měření koncentrace pomocí MALS ukázalo 1,2×10¹¹ VLP/mL v roztoku a ~6×10¹⁰ VLP/mL v hlavním vrcholu SEC, což naznačuje ~50 % efektivní návratnost.

Přínosy a praktické využití metody

• SEC-MALS poskytuje absolutní velikost, molární hmotnost a koncentraci částic bez závislosti na elutační době.
• Optimalizovaná kolona GTxResolve 2000 Å zajišťuje vysokou návratnost i rozlišení eVLP a jejich agregátů.
• Platformní přístup vhodný pro rutinní QC eVLP vakcín a vektorů v biotechnologickém prostředí.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metodiky o FFF-MALS pro eliminaci možné adsorpce na stacionární fázi.
• Automatizované online platformy pro real-time monitoring kvality eVLP během výroby.
• Integrace dalších detekčních modulů (fluorescence, viskozimetrie) pro komplexní charakterizaci bioterapeutik.

Závěr

Studie prokázala, že kombinace kolony GTxResolve 2000 Å MaxPeak Premier 3 µm s technikou SEC-MALS a DLS nabízí robustní a reprodukovatelnou metodu pro biophysikální charakterizaci eVLP. Optimalizovaná mobilní fáze a kolona umožnily spolehlivou separaci a kvantifikaci monomerů i agregátů, čímž se metoda stává cenným nástrojem pro vývoj a kontrolu kvality komplexních bioterapeutik.

Reference

1. He J., et al. Virus-like Particles as Nanocarriers for Intracellular Delivery of Biomolecules and Compounds. Viruses. 2022;14:1905.
2. Tariq H., Batool S., Asif S., Ali M., Abbasi B. H. Virus-Like Particles: Revolutionary Platforms for Developing Vaccines Against Emerging Infectious Diseases. Front Microbiol. 2022;12.
3. Zhang L., et al. Virus-like Particles as Antiviral Vaccine: Mechanism, Design, and Application. Biotechnol Bioprocess Eng. 2023;28:1–16.
4. Wetzel D., et al. Bioprocess Optimization for Purification of Chimeric VLP Displaying BVDV E2 Antigens Produced in Yeast Hansenula polymorpha. J Biotechnol. 2019;306:203–212.
5. Redecker A. S., Neek M., Smith P. E. J., Swartz J. R. Multifunctional Nanoparticle Platform for Targeted Delivery and Vaccines. iScience. 2025;28.
6. Camacho K. J., et al. Bridged Ethylene Polyethylene Oxide Surfaces to Improve Packing Materials for Widepore Size Exclusion Chromatography. J Sep Sci. 2024;47:e202400541.
7. Kulyabina E. V., et al. Virus-Like Particles: Properties and Characteristics of Reference Materials. In: Reference Materials in Measurement and Technology. Springer; 2024. p. 23–30.
8. Finny A. S., et al. Efficient Profiling of Lipid Nanoparticle Formulations Using Waters GTxResolve 2000 Å SEC Column, MaxPeak Premier 3 µm. Waters Application Notes. 2025.
9. Some D. VLP Characterization with the Light Scattering Toolbox. Wyatt Technology Application Note. 2019.
10. Challener C. A. Dynamic Light Scattering for Non-Destructive, Rapid Analysis of Virus-Like Particles. BioPharm Int. 2025;28:46–49.
11. Sripada S. A., et al. Multiangle Light Scattering as a Lentivirus Purification Process Analytical Technology. Anal Chem. 2024;96:9593–9600.
12. Striegel A. M., Brewer A. K., Zielke C. Size-Exclusion Chromatography with Multi-Angle Static Light Scattering. Nat Rev Methods Primers. 2025;5:40.
13. Wyatt P. J. Light Scattering and the Absolute Characterization of Macromolecules. Anal Chim Acta. 1993;272:1–40.
14. Wyatt P. J., Weida M. J. Method and Apparatus for Determining Absolute Number Densities of Particles in Suspension. 2004;13.
15. Wyatt P. J. Measurement of Special Nanoparticle Structures by Light Scattering. Anal Chem. 2014;86:7171–7183.
16. Bousse T., et al. Quantitation of Influenza Virus using Field Flow Fractionation and Multi-Angle Light Scattering for Quantifying Influenza A Particles. J Virol Methods. 2013;193:589–596.
17. Wei Z., et al. Biophysical Characterization of Influenza Virus Subpopulations Using Field Flow Fractionation and Multiangle Light Scattering: Correlation of Particle Counts, Size Distribution and Infectivity. J Virol Methods. 2007;144:122–132.
18. Deng J. Z., et al. SEC Coupled with In-Line Multiple Detectors for the Characterization of an Oncolytic Coxsackievirus. Mol Ther Oncolytics. 2022;24:139–147.
19. Padilla M. S., et al. Elucidating Lipid Nanoparticle Properties and Structure Through Biophysical Analyses. Nat Biotechnol. 2025;1–14.