Comparison of MALS-Based Analyses of Large mRNA Separated on Widepore SEC Columns

Význam tématu

Molekulární charakterizace mRNA terapeutik je klíčová pro vývoj nových léčiv a vakcín. Díky své velikosti a komplexitě vyžaduje mRNA pokročilé analytické metody s absolutní detekcí molární hmotnosti a rozměru. Spojení velikostně vylučovací chromatografie (SEC) s multiúhlovým rozptylem světla (MALS) nabízí robustní platformu pro kvantitativní i kvalitativní kontrolu mRNA vzorků, zejména v podmínkách omezeného množství vzorku.

Cíle a přehled studie

Tato studie porovnává výkon dvou širokopórových SEC kolon určených pro analýzu velkých mRNA: kolonu GTxResolve™ Premier SEC 1000 Å 3 µm a referenční kolonu výrobce A se nominálně podobnými parametry. Cílem bylo zjistit, která kolona poskytuje nižší šum MALS signálu, lepší oddělení oligomerů a robustnější stanovení molární hmotnosti a velikosti mRNA při nízkých množstvích vzorku.

Použitá metodika a instrumentace

Pro systematické porovnání byly během jedné série experimentů použity stejné provozní podmínky:

• Standard pro kalibraci: BSA (50 µg, 5 mg/mL)
• Vzorek mRNA: eSpCas9 mRNA (1 µg, 0,1 mg/mL)
• Chromatografický systém: ACQUITY™ Premier System (quaternary) s vysokopH kitem
• Detektory: Wyatt DAWN™ MALS (18 úhlů) a UV absorbance při 260 nm
• Kolony: GTxResolve Premier SEC 1000 Å 3 µm (7,8×300 mm) a výrobce A 1000 Å 2,7 µm (7,8×300 mm)
• Mobilní fáze: PBS pH 7,4 (10 mM fosfát, 200 mM KCl, 0,02 % NaN3), filtrovaná 0,2 µm
• Průtok: 1,0 mL/min, teplota kolony 22 °C, vzorku 5 °C, injekční objem 10 µL
• Příprava kolony: equilibrace 20 CV, ověření šumu MALS signálu

Hlavní výsledky a diskuse

Po provedení identického equilbračního postupu vykázala kolona GTxResolve Premier až čtyřnásobně nižší úroveň šumu MALS signálu než referenční kolona výrobce A. Při stanovení instrumentálních konstant (normalizace, zarovnání, korekce rozostření) na BSA byly u obou kolon naměřeny molární hmotnosti monomeru blízké teoretické hodnotě 66,4 kDa, avšak s vyšší přesností a menším rozptylem dat u GTxResolve kolony.
Při analýze limitovaného množství mRNA vzorku (1 µg) poskytla kolona GTxResolve monomerní a dimerické formy Cas9 mRNA s odchylkami do 15 % oproti predikci a spolehlivým stanovením poloměru gyrace. U kolony výrobce A byly chyby až 50 % a nižší důvěryhodnost výsledků.

Přínosy a praktické využití metody

SEC-MALS s optimální širokopórovou kolonou umožňuje rychlý screening mRNA vzorků dostupných v omezeném množství, např. v případě personalizované neoantigenové terapie. Metoda je vhodná pro vysokopropustné laboratorní provozy a QA/QC kontrolu stability a homogenity mRNA lékových forem.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se, že SEC-MALS bude i nadále hrát klíčovou roli při vývoji nukleových kyselin a lipidových nukleových komplexů. Budoucí inovace v návrhu analytických kolon (nízké uvolňování částic, široké spektrum pórů) podpoří validaci metod standardními proteiny i makromolekulami. Rostoucí diverzita mRNA léčiv a personifikovaných vakcín zvýší poptávku po citlivých, robustních a rychlých analytických postupech.

Závěr

Porovnání dvou širokopórových SEC kolon ukázalo, že kolona GTxResolve Premier SEC 1000 Å 3 µm poskytuje významně nižší MALS šum, lepší separaci oligomerů a spolehlivější určení molární hmotnosti a velikosti mRNA i při minimálním množství vzorku. Tato vlastnost usnadňuje high-throughput screening a podporuje vývoj nových mRNA terapeutik.

Reference

• D’Atri V., Imiołek M., Quinn C., Finny A., Lauber M., Fekete S., Guillarme D. Size exclusion chromatography of biopharmaceutical products: From current practices for proteins to emerging trends for viral vectors, nucleic acids and lipid nanoparticles. Journal of Chromatography A, 2024, 1722:464862.
• Waters/Wyatt Technical Note TN3506. Molecular Standards for Determining System Constants and Validating SEC-MALS-IV and FFF MALS Systems, 2018.
• Lavelay Kizekai L., Fletcher B., Fekete S., Addepalli B., Kendrick S., Chen M., Lauber M. Optimized Method Conditions for mRNA Characterization by SEC-MALS With GTxResolve™ Premier SEC 1000 Å 3 µm Columns. Waters Application Note 720008669, 2025.
• GenScript Product Information Sheet. SpCas9 Methylpseudouridine, 2025.
• Camacho K.J., Tchoul O., Xu Y., Finny A., Kizekai L., McLaughlin J., Byrd S., Addepalli B., Xu M., Lauber M. Bridged Ethylene Polyethylene Oxide Surfaces to Improve Packing Materials for Widepore Size Exclusion Chromatography. Journal of Separation Science, 2024, 47(20):e202400541.