Pore Size Distribution Study of GTxResolve™ SEC Columns for Analysis of Genetic Medicine Drug Substances and Products

Význam tématu

Analýza distribuce velikosti pórů SEC sloupců je klíčová pro spolehlivé stanovení agregátů a integrity komplexních genetických léčiv, jako jsou lipidové nanopartikule, plasmidy či virové vektory. Vhodná pore size distribution ovlivňuje separační selektivitu i kapacitu sloupce a tím přesnost výsledků.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo kvantifikovat rozdělení velikosti pórů (PSD) v nové řadě širokopórových GTxResolve SEC sloupců (450 Å, 1000 Å, 2000 Å) prostřednictvím chromatografického kalibračního modelu. Pro kalibraci byly použity flexibilní dsDNA makromolekuly a rigidní zlaté nanopartikule různé velikosti.

Použitá instrumentace

ACQUITY UPLC H-Class Bio QSM systém s TUV detektorem (260 nm pro nukleové kyseliny, 280 a 520–580 nm pro AuNPs), Wyatt DAWN MALS a QELS DLS modul pro určení velikosti eluentů, QuanRecovery MaxPeak HPS injekční láhve, GTxResolve SEC kolony (450 Å, 1000 Å, 2000 Å).

Použitá metodika

AuNPs byly modifikovány pomocí BSA nebo MUA ligandu a charakterizovány DLS. Eluční časy kalibrantů se transformovaly na partition coefficients (KSEC). Data velikosti (da) a KSEC byla fitována na upravený Richardův model s využitím Ogstonovy korelace pro derivaci PSD. Mobilní fáze obsahovaly PBS, SDS a izopropanol podle analyzátu, průtok 0,05–0,6 mL/min, teplota sloupce 25 °C, vzorků 6 °C.

Hlavní výsledky a diskuse

Křivky KSEC vs log da potvrdily shodu empirického mediánu PSD s nominálními hodnotami 450, 1000 a 2000 Å (odchylka < 10 %). Sloupec 2000 Å zajišťoval optimální separaci pro analyty > 100 nm, 1000 Å pro středně velké částice (~ 50–100 nm) a 450 Å primárně pro menší biomakromolekuly. Porovnání s MIP ukázalo, že iSEC poskytuje funkční distribuční profil reflektující přístupnost pórů za chromatografických podmínek.

Přínosy a praktické využití metody

• Umožňuje cílený výběr SEC sloupce pro specifickou velikost analyzátů genetických léčiv
• Zjednodušuje vývoj robustních, vysoce selektivních separačních metod
• Poskytuje přímé měření funkční dostupnosti pórů v provozních podmínkách

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s pokročilými detekčními technikami (např. online MALS/DLS) pro komplexní charakterizaci
• Adaptace kalibračního přístupu pro nové biologické modality a nanomateriály
• Vývoj sloupců s řízenou šířkou PSD a zlepšenou chemickou inertností

Závěr

Použití inverzní SEC kalibrace pomocí flexibilních a rigidních standardů umožnilo přesnou kvantifikaci funkčního PSD širokopórových GTxResolve sloupců. Metoda usnadňuje výběr optimálního sloupce a zvyšuje spolehlivost analýzy velkých biologických struktur.

Reference

1. Hong P., Koza S., Bouvier E.S.P. A review: size exclusion chromatography for the analysis of protein biotherapeutics and their aggregates. J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 35 (2012) 2923–2950.
2. Lemmens M., Dorsheimer L., Zeller A., Dietz-Baum Y. Non-clinical safety assessment of novel drug modalities: genome safety perspectives on viral, nuclease and nucleotide based gene therapies. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 896 (2024) 503767.
3. D’Atri V., Imiołek M., Quinn C., Finny A., Lauber M., Fekete S., Guillarme D. Size exclusion chromatography of biopharmaceutical products: from proteins to viral vectors and lipid nanoparticles. J. Chromatogr. A 1722 (2024) 464862.
4. Press release Wiley Analytical Science, Product News LC: Waters introduces new SEC columns (2024).
5. Fekete S., Imiołek M., Xu M., Lauber M. Quantitative metrics to properly describe solute elution in SEC. LCGC Int. 1(2) (2024) 30–34.
6. Camacho K.J. et al. Bridged ethylene polyethylene oxide surfaces to improve packing materials for widepore SEC. J. Sep. Sci. 47(20) (2024) e202400541.
7. Buff M. et al. Systematic comparison of wide pore SEC columns for characterization of gene therapy products. J. Chromatogr. A 1752 (2025) 465972.
8. Keim C., Li C., Ladisch C.M., Ladisch M. Modeling pore size distribution in cellulose stationary phases. Biotechnol. Prog. 18(2) (2002) 317–321.
9. Dai H., Dubin P.L., Andersson T. Permeation of small molecules in aqueous SEC vis-à-vis models for separation. Anal. Chem. 70 (1998) 1576–1580.
10. Lavelay K. et al. Optimized method for mRNA characterization by SEC-MALS with GTxResolve Premier SEC 1000 Å columns. Waters/Wyatt App Note 720008669 (2025).
11. Wei G.T., Liu F.K. Separation of nanometer gold particles by SEC. J. Chromatogr. A 836 (1999) 253–260.
12. Gromotka L. et al. Classification and characterization of multimodal nanoparticle size distributions by SEC. Nanoscale 14 (2022) 17354–17364.
13. Yang H., Koza S.M., Yu Y.Q. Determination of hydrodynamic radius with MaxPeak Premier protein SEC columns. Waters App Note 720007625 (2022).